一种微流体免疫分析平台

本发明属于食品安全检测，具体涉及一种微流体免疫分析平台及其应用。

背景技术：

1、内分泌干扰化合物被定义为“干扰存在于人体内部负责平衡、繁殖和发育过程的天然血源性激素的合成、分泌、运输、代谢、结合或消除的外源性制剂”，已经严重威胁到了生态安全和人类健康。以双酚a为例，双酚a(bpa)作为一种内分泌干扰化合物，已经被广泛用作聚碳酸酯塑料、环氧树脂和其他聚合物制造中的增塑剂，其产量在2013-2019年间以每年约4.60％的速度增长。这导致了大量的bpa在环境中积累，包括一系列环境沉积物、地表水和地下水等。同时，bpa可以从塑料容器迁移进入食物，或者通过食物链在人体内富集和积累，这进一步增加了人类日常饮食中摄入bpa的可能性。研究表明，成年人每天可能摄入30ng/kg-1μg/kg的bpa。而bpa在人体内的长期积累，可能导致一系列健康危害，包括对生殖系统、神经系统的损伤，乃至诱导癌症的发生。因此，开发一种针对内分泌干扰化合物的快速、灵敏的检测分析平台，对环境监测和食品安全等领域具有十分重要的意义。

2、目前，常规的检测方法，如高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等，往往面临检测仪器设备昂贵、成本高、步骤繁琐等困难，难以实现快速定量检测。因此，迫切需要研究一种快速、高通量、环境友好型的检测方法，实现对内分泌干扰化合物的检测。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微流体免疫分析平台，以实现对微量靶标物浓度的超快速、灵敏的定量检测；其中所需检测的内分泌干扰化合物记为靶标物。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、一种微流体免疫分析平台，其包括微流体芯片、荧光信号采集装置和分析模块；

4、所述微流体芯片包含进样口一、进样口二、进液通道、混合通道、磁分离池、分离通道和检测池；

5、所述进样口一和进样口二相互独立，分别通过进液通道一和进液通道二连接混合通道，形成y型结构；所述混合通道为s型结构，另一端连通磁分离池；磁分离池通过分离通道连通检测池；

6、进样口一用于注入靶标物竞争性抗原修饰的mnps和靶标物的标准溶液或样本溶液的混合溶液，进样口二用于注入靶标物抗体修饰的ucnps；

7、磁分离池用于磁性分离mnps以及与ucnps与mnps的结合物；所述检测池用于富集与靶标结合的ucnps；所述荧光信号采集装置用于采集检测池的荧光信号；且荧光信号采集装置和分析模块电性连接，以便将荧光信号输送至分析模块；

8、所述分析模块以标准溶液中待测靶标物浓度的对数和对应的荧光信号特征值进行线性拟合，建立靶标含量的荧光标准曲线。

9、进一步地，所述靶标物包括但不局限于双酚a。

10、进一步地，所述靶标物竞争性抗原修饰的mnps和靶标物的标准溶液或样本溶液的混合溶液注入的流速为5μl/min，靶标物抗体修饰的ucnps注入的流速为7.5μl/min。

11、进一步地，所述的磁分离时间为3-10min。

12、进一步地，所述荧光信号采集装置具体是采集的荧光信号特征值为540nm处的荧光强度；所述待测靶物标抗体修饰的ucnps和靶物标竞争性抗原修饰的mnps的制备步骤如下：

13、步骤s1、上转换纳米粒子(ucnps)的制备：

14、(a)取六水合氯化钇、六水合氯化镱、六水合氯化铒加入甲醇中，然后再加入油酸和1-十八稀充分混合后得到混合溶液，将混合溶液进行第一次加热反应，冷却至室温后，加入氢氧化钠、氟化铵和甲醇，进行第二次加热反应，随后继续升温进行第三次加热反应；反应结束后，将混合溶液冷却至室温，记为混合溶液a；

15、(b)在混合溶液a中再次加入六水合氯化钇与甲醇的混合液，然后加入油酸和1-十八稀充分混合后得到的溶液记为混合溶液b，将混合溶液b进行第四次加热反应，冷却至室温后，在混合溶液b中加入氢氧化钠、氟化铵和甲醇，进行第五次加热反应挥发甲醇，随后继续升温进行第六次加热反应；反应结束后，最后再加入乙醇混合后经离心获得沉淀物，经洗涤后得到的沉淀物即为上转换纳米粒子，记为ucnps；

16、进一步地，步骤s1的(a)中所述六水合氯化钇、六水合氯化镱、六水合氯化铒、甲醇的用量比例为0.78mmol:0.2mol:0.02mmol:10ml；所述甲醇、油酸和1-十八稀的体积比为10:6:15。

17、进一步地，步骤s1的(a)中所述1-十八稀、氢氧化钠、氟化铵、甲醇的用量关系为15ml：0.1g:0.1482g:10ml。

18、进一步地，步骤s1的(b)中所述混合溶液a中六水合氯化铒与加入的六水合氯化钇、甲醇的用量比例为0.02mmol:1mmol:10ml；所述甲醇、油酸、1-十八稀的体积比为10:3:8；1-十八稀、氢氧化钠、氟化铵、甲醇溶液的用量关系为8ml：0.04g:0.0555g:5ml。

19、进一步的，步骤s1中所述第一次加热温度为150-170℃，加热时间为25-35min；第二次加热温度为120-130℃，加热时间为25-35min；第三次加热温度为290-300℃，加热时间为40-60min；第四次加热温度为150-170℃，加热时间为25-35min；第五次加热温度为120-130℃，加热时间为25-35min；第六次加热温度为295-305℃，加热时间为35-45min；所述离心参数为8000-9000rpm，5-10min。

20、步骤s2、制备羧基修饰的ucnps：

21、取步骤s1制备得到的ucnps加入三氯甲烷和甲苯的混合溶液中，随后加入聚丙烯酸水溶液并密封，搅拌反应后，离心取沉淀使用乙醇和超纯水清洗并离心，得到具有亲水性的羧基修饰的ucnps，记为ucnps-cooh；

22、进一步地，步骤s2中所述ucnps、三氯甲烷、甲苯和聚丙烯酸水溶液的比例为50mg:(2-6ml):(4-10ml):(15-20ml)；所述聚丙烯酸水溶液浓度为15-20mg/ml。

23、进一步地，步骤s2中所述搅拌反应时间为24-48h；所述乙醇和超纯水的体积比为1:(0.6-1)；所述离心参数为8000-12000rpm转速下离心5-10min。

24、步骤s3、制备靶标物抗体修饰的ucnps：

25、取步骤s2得到的ucnps-cooh分散于含有碳酰二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲溶液中，进行第一次恒温孵育；孵育结束后，离心分离得到活化羧基的ucnps-cooh，分散在磷酸盐缓冲液中，得到活化羧基的ucnps溶液；将靶标物抗体蛋白加入到活化羧基的ucnps-cooh溶液中，于摇床中进行第二次恒温孵育反应，反应结束后经离心得到沉淀，即为靶标物抗体修饰的ucnps；

26、进一步地，步骤s3中所述ucnps-cooh、碳酰二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺、吗啉乙磺酸缓冲溶液的用量关系为10mg:20mg:10mg:10-15ml；所述活化羧基的ucnps-cooh、磷酸盐缓冲液的用量关系1mg:1ml；所述活化羧基的ucnps-cooh溶液与靶标物抗体蛋白的比例为10ml:500μg。

27、进一步地，步骤s3中所述第一次恒温孵育时间为3-3.5h，温度为37℃；所述第二次恒温孵育时间为8-12h，温度为37℃；所述离心的条件均为8000-10000rpm，5min。

28、步骤s4、制备磁性纳米粒子(mnps)：

29、分别取六水合氯化铁、二水合柠檬酸三钠、醋酸钠加入乙二醇中，搅拌充分溶解后，转移到反应釜中进行反应；反应结束通过磁性分离得到沉淀物，并使用乙醇和超纯水清洗，清洗后的沉淀物即为磁性纳米粒子，记为mnps；

30、进一步地，步骤s4中六水合氯化铁、二水合柠檬酸三钠、醋酸钠和乙二醇用量比例为5mmol:0.4mmol:(1.2-1.5g):(15-25ml)；反应的条件为190-210℃，8-12h；乙醇和超纯水的体积比为1:(0.6-1)。

31、步骤s5、制备靶标物竞争性抗原修饰的mnps：

32、取步骤s4制备的mnps，加入含有碳酰二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲溶液中，进行第一次孵育；孵育结束后，经磁分离得到活化羧基的mnps，并分散在磷酸盐缓冲液中，得到活化羧基的mnps溶液；

33、将靶标物竞争性抗原修饰的蛋白加入到活化羧基的mnps溶液中，于摇床中进行第二次恒温孵育反应，反应结束后经磁分离得到靶标物竞争性抗原修饰的mnps；

34、进一步地，步骤s5中所述mnps、碳酰二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺和吗啉乙磺酸缓冲溶液的比例为(8-12mg):10mg:5mg:(0.8-1.2ml)。

35、进一步地，步骤s5中第一次孵育条件为20-40℃，2-4h；活化羧基的mnps、磷酸盐缓冲液的用量关系(8-12)mg:1ml。

36、进一步地，步骤s5中所述活化羧基的mnps溶液与靶标物竞争性抗原修饰的蛋白的比例为10ml:500μg；所述第二次恒温孵育时间为8-12h，温度为37℃。

37、所述微流体芯片的混合通道包括半圆形混合通道、连接通道和1/4圆形通道；在从进样口一一端至磁分离池一端之间区域设有n排半圆形混合通道，靠近进样口一一端的记为第一排半圆形混合通道；

38、每一排含有6-10个半圆形混合通道，相邻的两个半圆形混合通道切向连通；第一排末端的半圆形混合通道通过连接通道连接1/4圆形通道，1/4圆形通道的另一端对应连通第二排端部的半圆形混合通道；按照此种方式依次串联至第n排，形成s型排布结构。

39、进一步地，所述的进液通道一和进液通道二形成的夹角为90°。

40、进一步地，所述的n排为13排，半圆形混合通道共计126个，1/4圆形通道共计12个，半圆形混合通道和1/4圆形通道的半径均为800μm。

41、进一步地，所述的进样口一、进样口二、磁分离池、检测池截面呈圆形，直径均为8mm，深度均为1cm。

42、进一步地，微流体芯片的通道宽度均为400μm，深度均为200μm。

43、本发明还提供了一种基于微流体免疫分析平台检测靶标物的用途，操作如下：

44、(1)标准曲线的构建：首先制备靶标物标准溶液，将靶标物竞争性抗原修饰的mnps和靶标物标准溶液从进样口一注入，同时将靶标物抗体修饰的ucnps从进样口二注入，混合微流体在混合通道中充分的混合、识别、结合之后流入磁分离池进行磁分离，在磁分离池中经外部磁场富集以吸附所有的mnps及ucnps与mnps的结合物，然后将剩余微流体通过空气压缩经分离通道进入检测池；在检测池上方使用荧光信号采集装置采集荧光信号，输送至分析模块，分析模块以靶标物标准溶液浓度的对数和荧光强度进行线性拟合，构建标准曲线；

45、(2)实际样本检测：首先获取待测试剂样本溶液，然后按照步骤(1)的操作，区别仅在于将靶标物标准溶液替换为待测试剂样本溶液，最终在检测池上方使用荧光信号采集装置采集荧光信号，代入构建的标准曲线计算得到对应靶标物的浓度。

46、优选的，步骤(1)中所述靶标物标准溶液的浓度为0.01～500ng/ml，靶标物包括但不局限于双酚a；靶标物竞争性抗原修饰的mnps和靶标物标准溶液混合的体积比为1:1；所述靶标物竞争性抗原修饰的mnps和靶标物标准溶液混合的混合溶液注入的流速为5μl/min，靶标物抗体修饰的ucnps注入的流速为7.5μl/min，注射时间为15-20min；磁分离的时间为3-10min；荧光信号采集装置采集荧光信号是540nm处的荧光强度。

47、本发明具有以下有益效果：

48、1、本发明公开了一种新型的微流体芯片，通过在微小尺寸的聚二甲基硅氧烷材质上集成大量弧形通道，实现了对微量流体的快速混合，将免疫传感器的反应时间缩短至8min，并且有效的集成了免疫传感器和靶标的混合、识别、结合、分离与检测整个过程，大幅简化了分析程序。

49、2、本发明以典型的内分泌干扰物bpa为模式靶标，构建了特异性识别体系，特殊的上转换发光过程可以有效避免复杂基质的背景荧光干扰，大幅度提高检测的灵敏度，实现了低至0.0135ng/ml的超灵敏检测。

50、3、本发明公开的方法展现了良好的选择性和抗干扰性能，能够在复杂的环境和食品样本中实现靶标的检测，同时极短的检测时间和简化的分析程序为现场检测提供了可能性。