用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,ald)是由于体内免疫功能紊乱而引起的一种特殊类型的慢性肝病，主要包括自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,aih)、原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,pbc)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis,psc)；其中，pbc和aih都有敏感性和特异性较高的自身抗体。

2、pbc是一种慢性自身免疫性肝内胆汁性淤积性疾病，其自身抗体主要包括ama、ama-m2、抗gp210抗体和抗sp100抗体。

3、大多数aih患者的血清中存在一种或多种高滴度的自身抗体，但这些自身抗体通常缺乏疾病特异性。根据自身抗体的不同可将aih分为两类：抗核抗体(antinuclearantibodies,ana)或抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibodies,asma)为阳性的1型、抗肝肾微粒体抗体-1型(anti-liver kidney microsome-1,抗lkm-1)或抗肝细胞溶质抗原-1型(anti-liver cytosol-1,抗lc-1)为阳性的2型aih，其中1型aih约占90％。

4、研究表明，约10.2％的aih患者起病时ana、asma阴性，但在后续随访期间有患者出现ana阳性。相较于经典aih患者，抗体阴性的aih患者的血清igg水平更低且起病时可能处在纤维化进展期，然而两组患者在起病时组织学炎症程度及半年内生化应答缓解率两方面均无统计学差异。因此，及时明确诊断并启动治疗，有助于改善抗体阴性aih患者的预后。

5、近年来已有多种方法用于检测自身免疫性肝病抗体，如间接荧光法，胡曼智造流式发光法，血液凝聚法，放免法或酶标法，但是上述方法通常为定性检测，其检测自身免疫性肝病的效率不能满足临床需求。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒、与抗原偶联的荧光编码微球以及检测自身免疫性肝病的试剂盒。具体技术方案如下：

2、根据本发明的一个方面，提供了一种用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒，所述试剂盒中包括微球包被液a或/和微球封闭液d，或者还包括微球活化液、微球保存液、活化剂a和活化剂b中的一种或者多种；

3、其中，所述微球包被液a中包括0.0736mol/l～0.0744mol/l醋酸钠溶液和0.177mol/l～0.201mol/l醋酸溶液，所述微球包被液a的ph值为4.4～4.6；

4、按每100ml计，所述微球封闭液d中包括5g～7g tris、0.43g～0.53g蔗糖、7g～9g海藻糖、0.9g～1g bsa、9g～2.1g peg6000、0.12g～0.18g tritonx-100和0.09ml～0.11mlproclin300，所述微球封闭液d的ph值为7.3～7.5。

5、在其中一个实施例中，按每100ml计，所述微球活化液中包括0.505g～0.555g2-吗啉乙磺酸和0.475g～0.525g 2-吗啉乙磺酸钠盐；所述微球活化液的ph值为5.9～6.1。

6、在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括微球包被液b、微球包被液c和微球包被液d中的至少一种；

7、可选地，按每100ml计，所述微球包被液b中包括1g～2g 2-吗啉乙磺酸和0.9g～1.0g 2-吗啉乙磺酸钠盐，所述微球包被液b的ph值为5.95～6.15；

8、可选地，按每100ml计，所述微球包被液c中包括0.09g～0.15g无水磷酸氢二钠、0.014g～0.034g二水磷酸二氢钠和0.08ml～0.12ml proclin300，所述微球包被液c的ph值为7.3～7.5；

9、可选地，按每100ml计，所述微球包被液d中包括0.09g～0.15g无水碳酸钠、0.09g～0.15g碳酸氢钠和0.06g～0.12g氯化钠，所述微球包被液d的ph值为9.5～9.7。

10、在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括微球封闭液a、微球封闭液b和微球封闭液c中的至少一种；

11、可选地，按每100ml计，所述微球封闭液a中包括0.152g～0.189g无水磷酸氢二钠、0.116g～0.147g二水磷酸二氢钠、1.686g～1.749g氯化钠、0.297g～0.328g bsa、0.003g～0.022g吐温20、1.844g～1.906g glycine、0.053ml～0.072ml proclin300和6.156ml～6.344ml山羊血清，所述微球封闭液a的ph值为6.4～6.6；

12、可选地，按每100ml计，所述微球封闭液b中包括4.5g～4.7gtris、0.43g～0.53g蔗糖、5.04g～5.34g海藻糖、0.92g～1.08g bsa、0.03～0.05g吐温20、5.85g～6.15gglycine、0.16g～0.2g tritonx-405和0.19ml～0.21ml proclin300，所述微球封闭液b的ph值为7.9～8.1；

13、可选地，按每100ml计，所述微球封闭液c中包括1.5g～1.7g tris、0.43g～0.53g蔗糖、0.9g～1.1g bsa、0.94g～1.06g peg2000和0.19ml～0.21ml proclin300，所述微球封闭液c的ph值为7.3～7.5。

14、在其中一个实施例中，按每100ml计，所述微球保存液中包括5.9g～6.1g hepes缓冲液、4.9g～5.1g蔗糖、95g～2.05g海藻糖、0.25g～0.35g bsa、1.45g～1.55g甘露醇、0.54g～0.66g乙二胺四乙酸二钠和0.09ml～0.11ml proclin300；所述微球保存液的ph值为7.3～7.5。

15、在其中一个实施例中，所述试剂盒满足如下条件中的至少一种：

16、(1)所述活化剂a中包括n-羟基硫代琥珀酰亚胺和所述微球活化液；

17、(2)所述活化剂b中包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和所述微球活化液。

18、一种与抗原偶联的荧光编码微球，采用上述的用于荧光编码微球与抗原偶联的试剂盒制备。

19、一种检测自身免疫性肝病的试剂盒，包括至少一个上述的与抗原偶联的荧光编码微球；所述抗原为lc-1抗原、lkm-1抗原、gp210抗原、sp100抗原、ama-m2抗原、cenp-b抗原、asma抗原、sla/lp抗原或ro52抗原。

20、在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括样本稀释液和荧光标记的羊抗人igg中的一种或多种。

21、在其中一个实施例中，按每100ml计，所述样本稀释液中包括0.006g～0.046g无水磷酸氢二钠、0.332g～0.432g二水磷酸二氢钠、0.28g～0.38g氯化钠和0.09ml～0.11mlproclin300。

22、与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：

23、本发明通过微球包被液和微球封闭液进行改进，能够提升荧光免疫微球与抗原的偶联效率；从而提升流式荧光检测的信噪比和检出效率，为临床上自身免疫性肝病的筛查、诊断与治疗提供参考。