一种基于金纳米壳的比色/光热/拉曼多模式侧流免疫分析检测方法

本发明涉及一种au纳米壳探针用于多模式侧流免疫分析检方法，其特征在于利用au纳米壳优异的局域表面等离子共振(lspr)与表面增强拉曼散射效应(sers)高特异性通过比色、拉曼、光热多模式高特异性定量分析检出sars-cov-2中和抗体。

背景技术：

1、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型，又称为(sars-cov-2或covid-19)是一种具有包膜的、不分节段的正链单股rna病毒，颗粒呈现圆形或椭圆形，直径为80至120纳米，属于网巢病毒目冠状病毒科。病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物，它造成了于2019年底暴发的2019冠状病毒病(covid-19)。sars-cov-2病毒可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的ace2为受体达到感染，主要感染的器官包括肺部、心脏、肾脏等多个器官。sars-cov-2病毒进入人体后，会引起先天免疫系统的免疫应答。sars-cov-2中和抗体通过与病原体结合来阻断病毒的细胞浸润和复制过程，从而防止sars-cov-2病毒感染。使用恢复期患者血液中的中和抗体实施sars-cov-2治疗是一种重要的诊疗方法。sars-cov-2病毒s蛋白的受体结合结构域片段(rbd)在病毒浸润细胞过程中至关重要，利用针对sars-cov-2rbd的抗体可能对恢复期患者具有保护作用。许多疫苗会诱导产生中和抗体，从而有效阻断宿主细胞上rbd与人细胞上ace-2蛋白之间的相互作用。这些中和抗体的水平可作为评估免疫保护有效性的重要参数，还能够开发针对sars-cov-2的疫苗策略，特别是在未来定期重新接种针对新的病毒变体的疫苗，例如delta和omicron变体。

2、传统的检测人体内抗体的方法包括沉淀反应、凝集试验补体结合试验；近年主流的方法有标记免疫测定,如酶联免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等(w.liu,etal.j.clin.microbiol.,58(6)(2020),p.e00461；q.liu,et al.acsappl.mater.interfaces,12(4)(2020),pp.4358-4365；x.f.cai,et al.j.infect.dis.,222(2)(2020),pp.189-193)。这些经典的检测方法具有较为出色的检出灵敏度，并且已经被实践证实其实用性。但是以上的方法，缺点也很明显，一方面，这些方法需要大型仪器和专业的操作人员，难以大范围推广实现快速实施检测；另一方面，上述方法检测时间往往很长，不利于现场的快速检出。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对即时现场检测中抗体检测耗时长、费人力、成本高、无法定量等不足，以au纳米壳作为侧流免疫分析的标记物，提供一种基于金纳米壳的比色/光热/拉曼多模式侧流免疫分析检测方法。

2、所述au纳米壳探针是具有空心球壳结构的球形纳米粒子，使用ag纳米粒子作为刻蚀模板制备au纳米壳，厚度为5.1～7.1nm，并以新冠病毒为实施例进行检测。

3、所述au纳米壳的制备方法和试纸条的组装喷涂，包括以下步骤：

4、1)ag种子的制备：往三口烧瓶中加入超纯水和柠檬酸钠溶液，搅拌加热并保持一段时间，然后加入硝酸银溶液后，快速加入新鲜配制的硼氢化钠溶液，剧烈搅拌下保持一段时间。溶液将由无色转变为黑色，最后转变为棕黄色，即得到银种子溶液。

5、2)制备ag溶胶：往三口烧瓶中加入超纯水和柠檬酸钠溶液，回流煮沸并保持一段时间后，依次加入银种子与硝酸银溶液，继续回流煮沸，加入柠檬酸钠溶液与硝酸银溶液，回流一段时间后再次加入柠檬酸钠溶液和硝酸银溶液，回流一段时间后冷却至室温，放入紫外暗箱中进行熟化，即得到银溶胶。

6、3)制备au纳米壳：向三口烧瓶中加入银溶胶和聚乙烯吡咯烷酮溶液，回流加热至一定温度后，缓慢加入氯金酸溶液。反应过程中每隔一段时间抽取少量反应溶液进行紫外可见光吸光度的检测，当吸收峰达到特定波长后移至冰水浴中终止反应。用超纯水离心洗涤三次后，加入mba的乙醇溶液，剧烈搅拌反应一段时间。离心洗去游离的mba并将其重新分散在水中。

7、4)au纳米壳表面修饰巯基聚乙二醇羧基(hs-peg-cooh)：取au纳米壳溶液，加入巯基聚乙二醇羧基溶液，在一定温度下剧烈搅拌。并用pbs离心洗涤三次。

8、5)缀合蛋白制备免疫功能化au纳米壳(inss)：向修饰了巯基聚乙二醇羧基的au纳米壳加入一定量的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)溶液，在室温下摇晃一段时间。使用pbs离心洗涤三次。向活化后的溶液加入适量的新冠病毒s蛋白，在剧烈振荡下反应一段时间并在适宜条件下放置过夜，使用pbs离心洗涤三次并分散在重悬浮液中，得到免疫功能化au纳米壳(inss)。

9、6)试纸条组装及喷涂：试纸条由pvc基板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组合粘贴合成。在硝酸纤维素膜上使用划膜喷金仪喷涂ace 2蛋白作为检测线(t线)和小鼠抗新冠病毒s蛋白抗体作为质控线(c线)。喷涂完成后干燥并用切条机切成小条。

10、在步骤1)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为20ml；超纯水的电阻为18mω，体积为75ml；加热温度为70℃，保持时间为15min；硝酸银溶液浓度为1％wt，体积为1.7ml；硼氢化钠溶液浓度为0.1％wt，体积为2ml；搅拌时间为2h，温度为70℃。

11、在步骤2)中，所述柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为4ml；超纯水体积为150ml；煮沸时间15min；所述种子溶液体积为20ml，硝酸银浓度为1％wt，体积为3.4ml；第二次第三次加入的硝酸银溶液浓度为1％wt，体积为3.4ml，柠檬酸钠溶液浓度为1％wt，体积为4ml；回流煮沸时间为1h，磁力搅拌转速为600r/min。

12、在步骤3)中，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液浓度为1mg/ml，体积为45ml；加入银溶胶体积为5ml，回流温度为100℃；氯金酸溶液浓度为1mm，氯金酸加入速率为300μl/min；抽取间隔时间为1min，当吸收峰达720nm时终止反应；所用mba的乙醇溶液浓度为1mm，体积为100μl，反应时间为1h，离心洗涤后分散在10ml水中。

13、在步骤4)中，所述巯基聚乙二醇羧基浓度为2mg/ml，体积为5ml；加入au纳米壳溶液体积为10ml，反应温度为37℃，时间为2h，所用pbs的ph值为6.8，浓度0.01m，离心洗涤转速为10000rpm，洗涤后体积为1ml。

14、步骤5)中，所述edc溶液浓度为10mg/ml，体积为50μl，nhs溶液浓度为5mg/ml,体积为50μl；摇晃时间为0.5h，离心洗涤所用pbs的ph值为7.4，浓度为0.01m。称取新冠病毒s蛋白质量为10μg，剧烈振荡时间为2h，并在4℃的条件下放置过夜。离心洗涤所用pbs的ph值为7.4，浓度为0.01m。

15、步骤6)中检测线所使用的ace 2蛋白浓度为0.8mg/ml，喷涂速率为1μl/cm；质控线所使用的小鼠抗新冠病毒s蛋白抗体浓度为1mg/ml，喷涂速率为1μl/cm；干燥温度为37℃，干燥时间为12h；试纸条长度为30cm，分切成100条，每条宽度3mm。

16、所述au纳米壳在多模式侧流免疫分析中的定性与定量应用。应用方法如下：

17、首先取20μl新冠病毒中和抗体样品与20μl inss一起加入到运行溶液(0.01mph＝7.4的pbs，含有1.5wt％tween-20,0.5wt％bsa)中，终体积为50μl，使用分散在模拟血清中浓度为0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5μg/ml的新冠病毒中和抗体溶液样本，并将试纸条的样品垫一端插入微孔板中。常温下等待15min，观察试纸条上显色带的颜色变化；同时，利用便携式拉曼光谱仪扫描检测线处的拉曼光谱，以1075cm-1处的光谱强度变化为纵坐标，中和抗体浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到拉曼线性方程；利用功率为2w，光照面积为1×1cm2的激光照射检测线，以5s内检测线处温度提升的程度为纵坐标，中和抗体浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到光热线性方程。用相同的方法得到检测结果。观察检测线处颜色，与检测标准溶液的试纸条对比，可对中和抗体浓度进行班定量检测；同时，记录下检测线上的拉曼强度，与工作曲线对比，带入拉曼线性方程，即可求得中和抗体的浓度；记录下检测线上5s内检测线处温度提升的程度，与工作曲线对比，带入光热线性方程，即可求得中和抗体浓度。

18、本发明给出一种新的检测新冠病毒中和抗体的方法，即使用一种au纳米壳探针来快速检测新冠病毒中和抗体浓度。首先利用强还原剂硼氢化钠和硝酸银制备银种子，种子溶液的颜色为棕黄色；然后利用逐步生长法，使在银种子逐渐增大至30nm左右；通过模板刻蚀法用氯金酸刻蚀银纳米粒子，形成了平均厚度为6.1nm，具有强烈的表面增强拉曼散射(sers)和局域表面等离子共振(lspr)性能的au纳米壳。au纳米壳为空心球壳结构，其sers、光热性能较单独的金纳米粒子更强。其拉曼光谱在1075cm-1处具有强烈的散射峰，其强度变化与au纳米壳颗粒的数量呈正相关，而在检测线处的颗粒数量与中和抗体的浓度呈现负相关，从而实现对中和抗体浓度的定量拉曼检测；同时，由其检测线温度上升的程度与au纳米壳颗粒的数量呈正相关，而在检测线处的颗粒数量与中和抗体的浓度呈现负相关，从而实现对中和抗体浓度的定量光热检测。这种即可利用sers又可利用光热信号的多模式侧流免疫分析检测方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、耗时少且无需专业的操作人员，利用人眼即可对抗体水平进行半定量分析，使用便携式拉曼光谱仪或便携式光热仪可实现灵敏的定量分析，可用于新馆病毒中和抗体的快速检测。