本发明属于药物分析,具体涉及一种乙磺酸尼达尼布中间体z3中有关物质的分离检测方法。
背景技术:
1、乙磺酸尼达尼布中间体z3(简称nin-z3),化学名称为(3e)-3-[甲氧基(苯基)亚甲基]-2-氧代吲哚啉-6-羧酸甲酯,英文化学名为:methyl(3e)-3-(methoxy(phenyl)methylene)-2-oxoindoline-6-carboxylate,分子式为c18h15no4,分子量为309.32,cas号为1168150-46-6,结构式如式ⅰ所示。
2、
3、nin-z3是乙磺酸尼达尼布合成过程中的重要中间体,根据合成工艺路线,我们研究发现nin-z3中可能存在杂质nin-sm1、杂质nin-z2b、杂质nin-z2和杂质nin-z3d。该四种杂质的存在在一定程度上影响着nin-z3的质量,例如杂质nin-z2为卤代烃类遗传毒性杂质,需在中间体z3中进行检测,并控制其含量低于0.1%的水平。所以,为保证乙磺酸尼达尼布产品的质量,有必要对杂质nin-sm1、杂质nin-z2b、杂质nin-z2和杂质nin-z3d进行控制。
4、杂质nin-sm1的结构式如式ⅱ所示,杂质nin-z2b的结构式如式ⅲ所示,杂质nin-z2的结构式如式ⅳ所示,杂质nin-z3d的结构式如式ⅴ所示。
5、
6、
7、关于乙磺酸尼达尼布中有关物质的分析方法,现有技术多有报道,例如公开号为cn108226314a、cn115888187a、cn106841495a、cn106748960a、cn114426512a等发明专利,这些专利公开了不同于乙磺酸尼达尼布中多种杂质的分离检测方法,但不包括杂质nin-sm1、杂质nin-z2b、杂质nin-z2和杂质nin-z3d,这些方法无法克服nin-z3溶液稳定性差,在液相系统中会出现降解平台峰的问题,所以难以实现上述四种杂质的有效测定。
技术实现思路
1、基于此,本发明的目的之一在于提供一种利用高效液相色谱法分离乙磺酸尼达尼布中间体z3及其有关物质的方法,该方法灵敏度高、专属性强,为乙磺酸尼达尼布中间体z3及其四种组分的定性和定量提供了技术支持。
2、为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
3、利用高效液相色谱法分离乙磺酸尼达尼布中间体z3及其有关物质的方法,所述有关物质包括杂质nin-sm1、杂质nin-z2b、杂质nin-z2中的任一种或多种,以及杂质nin-z3d;所述高效液相色谱法为:色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相;流动相包括流动相a和流动相b,所述流动相a为磷酸二氢钾缓冲溶液,流动相b为乙腈;通过梯度洗脱将乙磺酸尼达尼布中间体z3与所示有关物质进行分离;所述乙磺酸尼达尼布中间体z3的结构式如式ⅰ所示,所述杂质nin-sm1的结构式如式ⅱ所示,所述杂质nin-z2b的结构式如式ⅲ所示,所述杂质nin-z2的结构式如式ⅳ所示,所述杂质nin-z3d的结构式如式ⅴ所示;
4、
5、
6、进一步,洗脱顺序由先到后依次为杂质nin-sm1、杂质nin-z3d、nin-z3、杂质nin-z2b、杂质nin-z2。
7、进一步,所述方法可在32min内实现杂质nin-sm1、杂质nin-z3d、nin-z3、杂质nin-z2b和杂质nin-z2的同时分离和检测。
8、进一步,所述梯度洗脱程序设置如下:
9、在0分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为49~51:49~51;
10、在8分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为49~51:49~51;
11、在15分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为34~36:64~66;
12、在23分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为34~36:64~66;
13、在24分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为49~51:49~51;
14、在32分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为49~51:49~51。
15、作为优选,所述梯度洗脱程序设置如下:
16、在0分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50;
17、在8分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50;
18、在15分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为35:65;
19、在23分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为35:65;
20、在24分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50;
21、在32分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50。
22、进一步,所述流动相a的ph值为2.8~3.2,优选为3.0,所述磷酸二氢钾缓冲溶液的浓度为0.01mol/l~0.05mol/l,优选为0.03mol/l。
23、进一步,所述流动相流速为0.9ml/min-1.1ml/min,优选为1.0ml/min;所述色谱柱柱温为18℃-22℃,优选为;自动进样器温度≤5℃,优选为5℃。
24、作为优选,进样体积为10μl。
25、本发明的目的之二在于提供一种基于前述分离方法检测乙磺酸尼达尼布中间体z3及其有关物质的含量的方法,该方法可在32分钟内或大于32分钟的时间实现杂质nin-sm1、杂质nin-z3d、nin-z3、杂质nin-z2b和杂质nin-z2的定性和定量。
26、为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
27、基于前述分离方法检测乙磺酸尼达尼布中间体z3及其有关物质的含量的方法,所述方法包括如下步骤:
28、(1)分离:利用权利要求1-5任一项所述的方法分离所述乙磺酸尼达尼布中间体z3及所述有关物质;
29、(2)检测:分离后进入检测波长为225nm的检测器进行检测,得到色谱图;
30、(3)含量计算:根据测得的色谱图,采用加校正因子的自身对照法利用峰面积计算各组分含量。
31、进一步,杂质含量计算公式如下:
32、(1)
33、(2)总杂质=各单个杂质含量之和。
34、式中:ar—供试品溶液色谱图中单个杂质峰的峰面积;
35、as—对照溶液色谱图中主峰峰面积;
36、f—各单个杂质对应的校正因子。
37、进一步,杂质nin-sm1的校正因子为0.38,杂质nin-z3d的校正因子为1.0,杂质nin-z2b的校正因子为0.72,杂质nin-z2的校正因子为0.81,其他单个杂质的校正因子为1.0。
38、进一步,保留时间由短到长依次为:杂质nin-sm1、杂质nin-z3d、乙磺酸尼达尼布中间体z3、杂质nin-z2b、杂质nin-z2。
39、进一步,色谱柱规格为4.6mm×250mm,5μm;流动相a为浓度为0.03mol/l、ph值为3.0的磷酸二氢钾缓冲溶液,流动相b为乙腈;流动相流速为1.0ml/min,色谱柱柱温为20℃,自动进样器温度为5℃;按梯度洗脱程序进行线性梯度洗脱并得到色谱图;所述梯度洗脱程序设置如下:
40、在0分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50;
41、在8分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50;
42、在15分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为35:65;
43、在23分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为35:65;
44、在24分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50;
45、在32分钟,所述流动相a和所述流动相b的体积比为50:50。
46、进一步,保留时间在3.8±0.5,判定为杂质nin-sm1;保留时间在5.6±0.5,判定为杂质nin-z3d;保留时间在11.0±0.5,判定为乙磺酸尼达尼布中间体z3;保留时间在20.3±0.5,判定为杂质nin-z2b;保留时间在22.9±0.5,判定为杂质nin-z2。
47、上述保留时间可以对组份进行定性检测。
48、进一步,所述杂质nin-sm1在0.02998μg/ml~1.8738μg/ml线性范围内,y=1.6314x-0.0003;所述杂质nin-z3d在0.05054μg/ml~12.6347μg/ml线性范围内,y=0.6934x-0.014;所述乙磺酸尼达尼布中间体z3在0.05095μg/ml~12.7364μg/ml线性范围内,y=0.6224x+0.0429;所述杂质nin-z2b在0.05026μg/ml~1.8848μg/ml线性范围内,y=0.8618x+0.0004;所述杂质nin-z2在0.04872μg/ml~1.2179μg/ml线性范围内,y=0.7681x+0.0004;其中y为y轴,代表峰面积,x为x轴,代表浓度。
49、进一步,配制标准品,得到标准品的色谱图;测试样品所得色谱图,按加校正因子的自身对照法以峰面积进行含量计算。
50、所述标准品为已知组份含量,所述测试样品组份含量为未知。
51、所得的标准样品色谱图可以储存于数据库中,作为智慧药厂中质量控制的图谱素材,用于帮助机器人判定其生产的产品是否合格,对不合格的产品给出可定量的改进分析建议。
52、进一步,分离前,采用乙腈作为溶剂配制待测样品溶液、对照溶液和系统适用性溶液,具体检测方法如下:
53、步骤1.配制待测溶液:
54、样品溶液:取本品适量,精密称定,加乙腈超声溶解并稀释制成浓度0.5mg/ml的溶液,并于5℃保存。
55、对照溶液:精密量取供试品溶液5ml,置50ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀;精密量取1ml,置100ml量瓶中,用乙腈稀释至刻度,摇匀,即得。
56、系统适用性溶液:取nin-z3、杂质nin-sm1、杂质nin-z2、杂质nin-z2b、杂质nin-z3d对照品各适量,用乙腈使溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg以及nin-z3 0.5mg的溶液。
57、步骤2.取步骤1配制的系统适用性溶液、对照溶液和样品溶液,如10μl,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,采用加校正因子的自身对照法利用峰面积计算各组分含量。
58、本发明的有益效果在于:
59、1.本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱对nin-z3及相关杂质进行分离,以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈为流动相体系,进样盘控温5℃能保证供试品溶液的溶液稳定性,柱温选择20℃能改善降解平台峰,成功解决nin-z3溶液稳定性差,在液相系统中会出现降解平台峰的问题。
60、2.本发明所建立的色谱系统,乙磺酸尼达尼布中间体z3及各杂质峰型对称,nin-z3峰与相邻杂质峰之间能有效分离,各杂质间分离度均能满足要求,能同时对4个已知杂质及未知杂质进行检测,定量限低至0.03-0.05μg/ml,方法简单、准确、快速、有效。