本发明涉及生物医药检测，尤其是一种小鼠抗疲劳检测的方法。
背景技术：
1、体力疲劳是指机体持续活动到一定阶段时出现功能下降的生理现象，主要表现为困乏，无力，是目前出现最多的疲劳现象，也是疲劳研究的热点。持续性的体力疲劳极易诱发运动损伤，从而给长期运动者的身体带来隐患。体力疲劳产生的机制主要有四种学说，即能源衰竭学说、堵塞学说、保护抑制学说和自由基学说。这些机制主要是从能源的消耗、代谢产物的堆积、自由基的生成以及神经递质的调控方面使机体出现疲劳症状。
2、糖原、脂肪是维持生命活动的主要能源物质。身体的运动耐力与糖原水平直接相关。糖原分为肝糖原和肌糖原，在机体内既可以通过糖酵解方式产生能量，也可以通过糖异生方式储备能量，是维持糖酵解、氧化磷酸化和运动期间生理血糖水平的主要底物。机体在进行长时间工作时，主要消耗肌糖原提供能量，导致血糖浓度降低，血乳酸浓度增加。此时，如果能量得不到及时的补充，血糖在血清中的含量就会急剧下降，导致肝糖原的储备减少，进而产生疲劳症状。因此，增加肝脏和肌肉中的糖原水平是保持血糖平衡和延缓疲劳的重要措施。当储存在肝脏中的糖原耗尽时，atp合成速度会减慢，机体就会通过分解脂肪来补充所需要的能量。脂肪经脂肪酶水解生成甘油和脂肪酸，甘油再经活化和脱氢后，进入糖酵解途径代谢，同时生成atp；脂肪酸活化后进入线粒体，可以通过三羧酸循环提供atp，也可以通过β-氧化分解生成乙酰coa，乙酰coa在肝脏中生成酮体，并向肝外组织输送能量。
3、常用的生化指标主要包括肝糖原、肌糖原、尿素氮和血乳酸等。其中血乳酸和尿素氮是堵塞学说中两个最重要的指标。持续工作时，机体处于缺氧状态，肌肉中的丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下产生大量血乳酸导致机体内环境的 ph 值下降，细胞内相关酶活性发生改变，atp合成受到干扰，导致能量供应不足，使机体失去原有的动力，进而产生疲劳。另外，组织中h+增多，会导致肌钙蛋白对ca2+的摄取率降低，肌肉收缩能力变差，使机体产生疲惫感。当肌肉和脂肪都不足以为机体提供能量时，机体就会通过分解蛋白质来提供能量。蛋白质是生命活动的物质基础，其降解产物是各种氨基酸，氨基酸在转氨酶的作用下会生成氨，再通过鸟氨酸循环合成尿素氮。尿素氮是人体蛋白质代谢的最终产物。随着运动的加强，蛋白质分解速度加快，导致尿素氮的含量显著增加，尿素氮积累到一定程度时，机体耐受性变差，就会感到疲倦。
4、机体在新陈代谢过程中会产生自由基，如羟基自由基和超氧阴离子自由基，这些统称为活性氧（ros）。随着运动强度的增加，机体内自由基的生成也有所增加，而体内的抗氧化系统，如超氧化物歧化酶（sod）、谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）和过氧化氢酶（cat）可以清除肌肉细胞中ros。其过程为sod催化ros生成h2o2和o2，然后cat和gsh-px催化h2o2分解为h2o和o2。当ros与抗氧化系统失去平衡时，ros在体内积累，与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应生成丙二醛。该类物质会攻击线粒体和其他生物膜，造成细胞膜氧化损伤，同时损害骨骼肌和肝脏线粒体，最终引起疲劳。
5、目前，对于小鼠抗疲劳效果的检测方法常采用疲劳转棒检测和负重游泳检测，这种检测方法只能从表现上检测小鼠的疲劳效果，无法得到更多精确数据，查看小鼠身体内部各项含量的情况。
技术实现思路
1、本申请人针对上述现有的小鼠抗疲劳检测的缺点，提供一种小鼠抗疲劳检测的方法，通过多种测量方法来测定小鼠的抗疲劳能力，多项指标联合表征数据，检测结果准确可靠。
2、本发明所采用的技术方案如下：
3、一种小鼠抗疲劳检测的方法，进行小鼠负重游泳实验，末次给予受试物一定时间后，进行血乳酸测定，分别于游泳前、游泳后0min游泳后休息一定时间后采血进行乳酸测定，血乳酸曲线下面积=5×（游泳前血乳酸值+3×游泳后0min血乳酸值+2×游泳后休息一定时间后血乳酸值）。
4、作为上述技术方案的进一步改进：
5、末次给予受试物30min后，进行血乳酸测定。
6、游泳后休息20min后采血进行乳酸测定。
7、对所述采血后的小鼠分取其肝和腓肠肌经生理盐水漂洗后用滤纸吸干后，用生理盐水制备肝和腓肠肌含量为10%的组织匀浆液，离心取上清液，测定ck（血清肌酸激酶）和ldh（血清）的含量。
8、在4℃条件下，以3500r/min离心10min后取上清液。
9、采用elisa试剂盒测定ck（血清肌酸激酶）和ldh（血清）的含量。
10、小鼠进行游泳试验，不加负载，休息一段时间后采集全血，血液凝固后进行离心并取血清备用，采用二乙酰-肟法对每个小鼠的血清尿素氮含量进行测定。
11、所述血液在4℃冰箱中存放约3小时凝固。
12、将小鼠置于水温为30℃的游泳箱中进行90分钟的游泳试验。
13、游泳结束后，小鼠休息60分钟。
14、本发明的有益效果如下：
15、疲劳产生的一个重要原因是代谢产物的堆积。由于长时间、高强度的运动，机体代谢增加，如未及时清除这些多余的代谢产物，身体就会产生酸痛感等感觉，代谢系统也发生不正常的功能，从而导致代谢产物的堆积。bun是通过膳食和肝脏中的组织代谢蛋白质产生的，它释放氨基酸到血液中，并将其运输到肾脏排泄。氨基酸的种类也比较繁多，各氨基酸的代谢速度也不太一样，在运动消耗能量的时候，蛋白质会分解成氨基酸，氨基酸如未通过体液循环代谢到身体外，在血液中的含量就会越来越高，被检测浓度越来越大，显示在疲劳时消耗的氨基酸也增多了，身体的劳累程度也会增大。测定血尿素氮是人体运动过程中蛋白质代谢的主要代谢产物，是衡量人体耐力的重要指标。换句话说，bun水平高意味着耐力能力低，导致疲劳。所以，本发明研究小鼠抗疲劳性检测时，选择了检测血清中的尿素氮生化指标，作为反应小鼠在疲劳后的反应身体的疲劳。
16、疲劳的消除和疲劳产生的原理，长时间的剧烈运动消耗氧气，加速体内的糖酵解，诱导大量乳酸及其离子乳酸形式的产生，从而触发一个过程，最终减少钙离子的再吸收和随后的释放，这是导致疲劳的主要因素。因此，血乳酸水平是疲劳的另一个重要指标的身体。
17、ck是一种肌肉收缩、参与细胞的能量储存方面起重要作用的激酶。广泛存在于脑组织，心肌和骨骼肌内，调节肌肉的收缩。在指标评估中，ck主要用于心肌的诊断，如在疲劳出现后，ck指标的变化较ast、lod变化的程度更高，所以本发明选择ck去评价疲劳的程度。疲劳过后的小鼠ck含量会有明显的增加，同样证明了ck随运动性疲劳的增大而升高。
18、本发明通过在不同阶段测试小鼠体内具体乳酸、ck（肌酸磷酸激酶）、ldh(血清)和bun（血尿素氮）的含量来测定小鼠的抗疲劳能力，检测结果精确可靠，更具有说服力。本发明的试验方案由多个方法、多项指标联合表征数据，可以更有效反应出小鼠的抗疲劳能力。
1.一种小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：进行小鼠负重游泳实验，末次给予受试物一定时间后，进行血乳酸测定，分别于游泳前、游泳后0min游泳后休息一定时间后采血进行乳酸测定，血乳酸曲线下面积=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min血乳酸值+2×游泳后休息一定时间后血乳酸值)。
2.按照权利要求1所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：末次给予受试物30min后，进行血乳酸测定。
3.按照权利要求1所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：游泳后休息20min后采血进行乳酸测定。
4.按照权利要求1所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：对所述采血后的小鼠分取其肝和腓肠肌经生理盐水漂洗后用滤纸吸干后，用生理盐水制备肝和腓肠肌含量为10%的组织匀浆液，离心取上清液，测定ck（血清肌酸激酶）和ldh(血清)的含量。
5.按照权利要求4所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：在4℃条件下，以3500r/min离心10min后取上清液。
6.按照权利要求4所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：采用elisa试剂盒测定ck（血清肌酸激酶）和ldh(血清)的含量。
7.按照权利要求1所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：小鼠进行游泳试验，不加负载，休息一段时间后采集全血，血液凝固后进行离心并取血清备用，采用二乙酰-肟法对每个小鼠的血清尿素氮含量进行测定。
8.按照权利要求7所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：所述血液在4℃冰箱中存放约3小时凝固。
9.按照权利要求7所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：将小鼠置于水温为30℃的游泳箱中进行90分钟的游泳试验。
10.按照权利要求7所述的小鼠抗疲劳检测的方法，其特征在于：游泳结束后，小鼠休息60分钟。