一种测定茶鲜叶、红茶和茶汤中丁氟螨酯及其三种代谢产物残留量的方法

本发明属于茶叶农药残留检测，具体涉及一种测定茶鲜叶、红茶和茶汤中丁氟螨酯及其三种代谢产物残留量的方法。

背景技术：

1、茶园生态系统复杂多样，病虫害是茶园管理中最大的问题，严重影响茶叶的产量和品质。螨类在茶园中扮演着正反两面角色。植食性螨作为茶园的一种害螨，具有体型小、隐蔽性强、孵化换代快、繁殖能力强和易于产生抗性等特点。而作为正面角色的捕食性螨以植食性螨为食，是植食性螨的重要天敌，以螨治螨，是高效的绿色防治方法之一。然而，相较于生物绿色防治，化学防治是茶农最常用的防治螨类的手段。但长期使用一种杀螨剂会使害螨产生抗性，甚至使害螨对其他杀螨剂产生交互抗性，从而导致害螨的猖獗。为了减少螨类抗性及交互抗性等问题，可以通过轮换使用作用机制不同的杀螨剂、限制使用次数以及开发一些具有新作用点的新型杀螨剂等方法。

2、丁氟螨酯(cyflumetofen,2-methoxyethyl(rs)-2-(4-tert-butylphenyl)-2-cyano-3-oxo-3-(α,α,α-trifluoro-o-tolyl)propionate,c24h24f3no4)，是由日本大冢农业科技有限公司开发的一种新型苯甲酰乙腈杀螨剂，商品名为danisraba，于2007年推出。丁氟螨酯是线粒体电子传递链中复合物ⅱ的抑制剂，其在螨虫体内的作用方式是在被代谢为ab-1后，通过影响其作用位点来抑制线粒体复合物ⅱ(即琥珀酸脱氢酶)。代谢物ab-1在极低浓度下便可立即抑制线粒体复合物ⅱ，并且丁氟螨酯在螨虫体内主要被代谢为ab-1。此外，丁氟螨酯和ab-1对捕食性螨等非目标生物的抑制作用较弱，对蜘蛛螨的毒性是捕食性螨的1万多倍。其代谢物ab-1对蜘蛛螨体内琥珀酸脱氢酶的抑制作用是捕食性螨的200倍，具有较强的靶标选择性。据我们所知，关于代谢物ab-1的研究较少，然而在环境代谢和加工代谢过程中，均会有代谢物ab-1的产生，因此，本发明将其作为主要研究代谢物之一。同时将通过植物或环境代谢产生的代谢产物b-1和b-3作为主要的代谢物进行研究。

3、然而，丁氟螨酯尚未在我国茶树上登记。因此，我们首先采用直接接触法和残留接触法进行了20％丁氟螨酯悬浮剂对茶树红蜘蛛的药效试验。结果表明，丁氟螨酯能有效防治茶树红蜘蛛。在此前期实验的基础上，本发明建立了茶鲜叶、红茶、和茶汤中丁氟螨酯及其代谢物(b-1、b-3和ab-1)的uplc-ms/ms残留分析方法。从而为后续研究茶叶中丁氟螨酯及其代谢物的残留降解行为以及饮茶后的膳食风险评估提供依据。对确定茶叶中丁氟螨酯的最大残留限量，指导茶园合理施用丁氟螨酯，确保茶叶质量安全具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种测定茶鲜叶、红茶和茶汤中丁氟螨酯及其三种代谢产物残留量的方法的技术方案。本发明通过比较不同酸碱度的提取溶剂、不同净化填料以及不同流动相等，建立了茶鲜叶、红茶和茶汤中丁氟螨酯及其三种代谢产物的残留分析方法。

2、本发明具体通过以下技术方案实现：

3、本发明提供了一种测定茶鲜叶、红茶和茶汤中丁氟螨酯及其三种代谢产物残留量的方法，其包括以下步骤：

4、1)样品提取净化：对茶鲜叶、红茶或茶汤样品，采用1％甲酸乙腈提取，多壁碳纳米管与纳米氧化锆分散固相萃取净化，浓缩后乙腈定容；

5、2)待测物检测：采用acquity hss t3 1.8μm色谱柱分离，超高效液相色谱串联质谱检测丁氟螨酯及其三种代谢产物；

6、3)标准曲线：配制丁氟螨酯及其三种代谢产物标准储备液，用乙腈稀释成混合标准溶液20mg/l，然后将步骤1)处理后的鲜叶、红茶或茶汤基质分别配制成2、1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.005mg/l的标准溶液，uplc-ms/ms进样分析，每个浓度测定3次，以浓度为横坐标x，峰面积平均值为纵坐标y，得到丁氟螨酯及其三种代谢产物的标准曲线和线性相关系数；

7、4)回收率等方法参数：进行不同浓度添加回收率样品试验测定，计算添加回收率、相对标准偏差、方法的定量限，满足残留分析要求。

8、进一步，所述步骤1)中茶鲜叶具体提取净化为：经磨碎后称取5g鲜叶至离心管中，加入8ml 2％甲酸水，充分涡旋混匀后静置10min，再加入15ml 1％甲酸乙腈，涡旋混匀后振荡5min，超声10min，加入3g nacl，涡旋混匀振荡5min后，10000rpm/min离心5min，吸取上层有机相溶液4.8ml加入装有0.2g多壁碳纳米管和0.2g纳米氧化锆的10ml离心管中，涡旋净化1min后离心，取上清液3ml于50ml鸡心瓶中，浓缩干后，加入1ml乙腈定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，uplc-ms/ms待测。

9、进一步，所述步骤1)中红茶具体提取净化为：经磨碎后称取2g红茶至离心管中，加入10ml 2％甲酸水，充分涡旋混匀后静置10min，再加入10ml 1％甲酸乙腈，涡旋混匀后振荡5min，超声10min，加入3.5g nacl，涡旋混匀振荡5min后，10000rpm/min离心5min，吸取上层有机相溶液6ml加入装有0.25g多壁碳纳米管和0.25g纳米氧化锆的10ml离心管中，涡旋净化1min后离心，取上清液4ml于50ml鸡心瓶中，浓缩干后，加入1ml乙腈定容，超声辅助溶解，过0.22μm滤膜至进样瓶中，uplc-ms/ms待测。

10、进一步，所述步骤1)中茶汤具体提取净化为：将红茶粉按照茶水比1:50的标准加入沸水冲泡，10min后双层滤纸抽滤两次，获得茶汤，取20ml茶汤至50ml离心管，加入20ml1％甲酸乙腈，涡旋混匀后振荡5min，加入7g nacl，涡旋混匀振荡5min后，10000rpm/min离心5min，取全部上层有机相溶液，再加入20ml 1％甲酸乙腈重复提取一次，涡旋混匀振荡5min，超声10min后离心，合并两次上清液，浓缩干后，加入2ml乙腈定容，超声辅助溶解，取1.2ml加入装有0.025g多壁碳纳米管和0.05g纳米氧化锆的2ml离心管中，涡旋净化1min后，12000rpm/min离心5min，过0.22μm滤膜至进样瓶中，uplc-ms/ms待测。

11、进一步，所述步骤2)中色谱条件为：acquity hss t3 1.8μm，规格2.1×100mm；柱温45℃；进样量5μl；流速0.25ml/min；流动相a为0.1％甲酸甲醇，b为0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序为：0-1.5min，5％-70％ a；70％a保持0.5min；2-3.5min，70％-90％a；3.5-4.5min，90％-100％a，随后100％a保持2min；6.5-7min，100％-5％a，整个分析时间为9.5min。

12、进一步，所述步骤2)中质谱条件为：电喷雾正/负离子多反应检测模式；电喷雾毛细管电压3.5kv；离子源温度150℃；脱溶剂气n2温度350℃，流速700l/hr；锥孔反吹气n2流速60l/hr。

13、本发明方法不同基质中所有化合物的标准曲线线性相关系数均在均在0.999以上(除红茶基质中代谢物ab-1)，平均添加回收率在85.3％-116.9％，相对标准偏差小于等于10.5％，方法定量限小于等于0.005mg/kg(0.5μg/l)(除代谢物b-1在干茶中≤0.01mg/kg，茶汤中≤1.0μg/l)。本方法满足残留分析要求，能够为茶鲜叶、红茶和茶汤中丁氟螨酯及其三种代谢产物的研究检测提供分析方法。