一种热休克蛋白90α化学发光检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及临床血液免疫检测，特别涉及一种热休克蛋白90α化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、

2、肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中由于基因的表达水平的变化而生成或减少的抗原和其他生物活性物质，可用于肿瘤的早期诊断、分期监测肿瘤进程和评价药物的治疗效果(asco，1996)。它会对肿瘤的临床治疗带来巨大的影响，尤其当它能够在临床病症出现之前被检测到，或者可以用于治疗效果的实时检测时。

3、目前用于肿瘤早期诊断的肿瘤标志物，大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能在体检中广泛应用。例如，对于肝癌，甲胎蛋白和超声波检查是普遍采用的诊断高危病人的方式，并且确实显著提高了肝癌病人的生存率，但灵敏度比较低；肿瘤抗原ca-125有更高的灵敏度，但却缺乏特异性。同样地，用于乳腺癌检测的血液肿瘤标志物ca15-3因灵敏度低在早期诊断中几乎没用。因此，肿瘤的早期诊断，以及良性和恶性肿瘤的区分仍然是一个临床难题，需要新的技术和方法来发现新的肿瘤标志物和提高肿瘤标志物检测的灵敏度和可信度。

4、肿瘤蛋白质组学的出现为新的肿瘤标志物的发现，和肿瘤的普查、早期诊断以及预后带来了新的希望。肿瘤的恶性转化会伴随有某些蛋白表达水平的变化，这些变化能够在蛋白水平被定性和定量的检测到，这就是肿瘤蛋白质组学的主要研究内容。由此获得的肿瘤蛋白质信息能够为更加有效的诊断、预后肿瘤和评价治疗效果提供有价值的帮助。目前，为了满足肿瘤的临床诊断和治疗的需求，肿瘤标志物的研发亟待加速。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种热休克蛋白90α(hsp90α)化学发光检测试剂盒及其制备方法。

2、本发明的第一方面在于提供一种热休克蛋白90α化学发光检测试剂盒，包括以下组分：

3、热休克蛋白90α标准品；固相载体；包含热休克蛋白90α捕获抗体的溶液r1；包含热休克蛋白90α标记抗体的溶液r2；化学发光底物a；化学发光底物b；分析物稀释液；洗涤液。

4、进一步，所述热休克蛋白90α标准品为基因重组表达的热休克蛋白90α经过系列稀释后所得。

5、进一步，所述固相载体为磁微粒、偶联有热休克蛋白90α单克隆抗体的磁微粒、包被有热休克蛋白90α单克隆抗体的不透明微孔板、包被有亲和素及其衍生物的微孔板中的任意一种。

6、进一步，所述磁微粒为粒径0.1-5μm的fe2o3或fe3o4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团，所述活性功能基团为对甲苯磺酰基、羧基、氨基中的一种或多种组合，优选羧基。

7、进一步，r1中，所述热休克蛋白90α捕获抗体为鼠源抗体、兔源抗体、鸡源抗体中的任意一种。

8、进一步，r2中，所述热休克蛋白90α标记抗体为鼠源抗体、兔源抗体、鸡源抗体中的任意一种。

9、进一步，所述化学发光底物a包含鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺衍生物、3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)、过氧化脲、过氧化氢、硝酸、硫酸、盐酸中的一种或多种组合。

10、进一步，所述化学发光底物b包含对碘苯酚、十六烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、苯扎氯铵、苯扎溴铵、氢氧化钠、硝酸、硫酸、盐酸、四苯硼钠、铁氰化钾、肉桂酸、过氧化氢中的一种或多种。

11、进一步，所述洗涤液包含缓冲液、表面活性剂、防腐剂中的一种或多种组合，所述洗涤液的ph值为6～9。

12、进一步，以质量体积比(m/v)计，溶液r1中包含0.01％-1％的缓冲液、0.05％-0.2％防腐剂、0.01％-5％表面活性剂、0.1％-10％蛋白保护剂、0.0001-1％标记的热休克蛋白90α单克隆抗体结合物。

13、进一步，所述r2中，包含生物素标记的hsp90α单克隆抗体结合物、辣根过氧化物酶标记的hsp90α单克隆抗体结合物、碱性磷酸酶标记的hsp90α单克隆抗体结合物、吖啶酯及其衍生物标记的hsp90α单克隆抗体结合物中的任意一种；

14、其中，所述生物素标记的hsp90α单克隆抗体结合物为生物素和hsp90α单克隆抗体形成的复合物，所述辣根过氧化物酶标记的hsp90α单克隆抗体结合物为辣根过氧化物酶和hsp90α单克隆抗体形成的复合物，所述碱性磷酸酶标记的hsp90α单克隆抗体结合物为碱性磷酸酶和hsp90α单克隆抗体形成的复合物，所述吖啶酯及其衍生物标记的hsp90α单克隆抗体结合物为吖啶酯及其衍生物和hsp90α单克隆抗体形成的复合物。

15、进一步，所述分析物稀释液包含缓冲液、表面活性剂、防腐剂、蛋白保护剂中的一种或多种组合，所述分析物稀释液的ph值为6～9。

16、进一步，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷磷酸盐缓冲液(pbs)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris-hcl)、3-(n-吗啉基)丙磺酸缓冲液(mops)、2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲液(mes)、硼酸盐缓冲液(bbs)、甘氨酸缓冲液(tris-gly)或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(hepes)中的一种或多种组合，所述缓冲液的ph值为6～9；

17、所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物或聚乙二醇辛基苯基醚中的一种或多种组合；

18、所述防腐剂选自叠氮化钠、n-甲基-异噻唑酮、n'-亚甲基-双[n'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或proclin 300中的一种或多种组合；

19、所述蛋白保护剂选自酪蛋白酸钠、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清、胎牛血清、新生牛血清、鱼胶蛋白中的一种或多种组合。

20、本发明第二方面在于提供上述热休克蛋白90α化学发光检测试剂盒的制备方法，所述热休克蛋白90α标准品通过以下步骤制备得到：

21、(1)取基因重组表达的热休克蛋白90α抗原，使用校准品稀释液将抗原稀释至1μg/ml；

22、(2)再使用校准品稀释液将1μg/ml抗原稀释至80ng/ml，搅拌混匀备用；

23、(3)再次使用校准品稀释液将80ng/ml抗原系列分别稀释至40ng/ml，20ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，分别搅拌混匀备用；

24、(4)将上述6个热休克蛋白90α抗原校准品分别分装成0.5ml/支，并进行检验，贴标于4摄氏度保存备用。

25、进一步，所述固相磁微粒载体制备步骤为：

26、(1)取磁微粒质量含量为2.5％的磁微粒悬浮液，磁板分离弃上清，用去离子水水洗磁颗粒；

27、(2)用0.05mol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液重复洗涤磁微粒3次；

28、(3)使用磁微粒保存液悬浮磁微粒，分装至5ml/瓶。

29、进一步，包含热休克蛋白90α捕获抗体的溶液r1的制备步骤(热休克蛋白90α捕获抗体为生物素标记的热休克蛋白90α单克隆抗体)：

30、(1)生物素标记的热休克蛋白90α单克隆抗体的制备方法如下：

31、1)将1mg热休克蛋白90α单克隆抗体1透析并溶解在20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液中，2～4℃保存备用；

32、2)将2mg生物素使用20mm、ph值为7.5磷酸盐缓冲液稀释成2μm，2～4℃保存备用；

33、3)将步骤1)与2)获得的液体混合，于800rpm/min、25℃条件下避光反应30-60分钟；

34、4)用20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液透析24-48小时，加入等体积的甘油后于-20℃下保存备用；

35、(2)使用r1溶液的稀释液将步骤(1)得到的生物素化的热休克蛋白90α单克隆抗体1进行适当比例稀释，搅拌混匀即为含有热休克蛋白90α单克隆抗体1的溶液(简称r1)，并进行分装，贴标，2～4℃保存备用。

36、进一步，包含热休克蛋白90α标记抗体的溶液r2的制备：

37、(1)当热休克蛋白90α标记抗体为辣根过氧化物酶标记的hsp90α单克隆抗体2形成的复合物时，r2制备步骤如下：

38、1)取1.0mg热休克蛋白90α单克隆抗体，加入0.5～1.0ml浓度为20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液溶解，2～4℃保存备用；

39、2)取2.0mg辣根过氧化物酶，加入0.5ml浓度为20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液，溶解后取出0.06～0.12ml，加入0.1ml浓度为0.1m的naio4溶液，室温下避光反应20-60分钟；

40、3)将步骤1)与2)获得的液体混合，并加入0.2ml的0.2m、ph值为9.5碳酸盐缓冲液调ph至8.5-9.4，室温下避光反应4～6小时；

41、4)向步骤3)获得的溶液中加入0.1ml浓度为5mg/ml的nabh4溶液，室温下避光反应1～2小时；

42、5)用20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液透析12～24小时，加入等体积的甘油后于-20℃下冷冻保存备用；

43、6)使用r2溶液的稀释液将步骤5)得到的辣根过氧化物酶标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2进行适当比例稀释，搅拌混匀即为包含热休克蛋白90α标记抗体的溶液r2，并进行分装，贴标，2～4℃保存备用。

44、(2)当热休克蛋白90α标记抗体为碱性磷酸酶标记的hsp90α单克隆抗体2形成的复合物时，r2制备步骤如下：

45、1)取1.0mg热休克蛋白90α单克隆抗体，加入0.5～1.0ml浓度为20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液溶解，2～4℃保存备用；

46、2)取2.0mg的碱性磷酸酶，加入0.5ml浓度为20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液，溶解后取出0.06～0.12ml，加入0.1ml浓度为0.1m的naio4溶液，室温下避光反应20-60分钟后，并加入0.1ml的乙二醇溶液，2～4℃保存备用；

47、3)将步骤1)与2)获得的液体混合，并加入0.2ml的0.2m、ph值为9.5碳酸盐缓冲液调ph至8.5-9.4，室温下避光反应4～6小时；

48、4)向步骤3)获得的溶液中加入0.1ml浓度为5mg/ml的nabh4溶液，室温下避光反应1～2小时；

49、5)用20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液透析12～24小时，加入等体积的甘油后于-20℃下冷冻保存备用；

50、6)使用r2溶液的稀释液将步骤5)得到的碱性磷酸酶标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2进行适当比例稀释，搅拌混匀即为包含热休克蛋白90α标记抗体的溶液r2，并进行分装，贴标，2～4℃保存备用。

51、(3)当热休克蛋白90α标记抗体为吖啶酯标记的hsp90α单克隆抗体2形成的复合物时，r2制备步骤如下：

52、1)将1mg热休克蛋白90α单克隆抗体1透析并溶解在20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液中，2～4℃保存备用；

53、2)将2mg吖啶酯使用二甲基亚砜(dmso)稀释成2μm，2～4℃保存备用；

54、3)将步骤1)与2)获得的液体混合，于800rpm/min、25℃的条件下避光反应30-60分钟；

55、4)用20mm、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液透析24-48小时，加入等体积的甘油后于-20℃下保存备用；

56、5)使用r2溶液的稀释液将步骤4)得到的吖啶酯标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2进行适当比例稀释，搅拌混匀即为包含热休克蛋白90α标记抗体的溶液r2，并进行分装，贴标，2～4℃保存备用。

57、不同标记物标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2所用发光底物液的配置不同。

58、进一步，化学发光底物a和b配置如下：

59、(1)适用于辣根过氧化物酶标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2的发光底物a和b液的配置如下：

60、所述化学发光底物a液：

61、1)配制0.05mm、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液；

62、2)将终浓度为3～4mm的鲁米诺加入步骤1)所述的缓冲液中，混匀，2～4℃避光保存；

63、所述化学发光底物b液：

64、1)配制50mm、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液；

65、2)将终浓度为0.5～0.7mm的四苯硼钠、1.42mm的铁氰化钾、0.38mm的肉桂酸、7.56mm的过氧化氢加入到1000ml步骤1)所述的缓冲液中，混匀，2～4℃保存；

66、使用方法：使用前将a液与b液按1∶1(v/v)比例混合后使用。

67、(2)适用于碱性磷酸酶标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2的发光底物a和b液的配置如下：

68、所述化学发光底物a液：

69、1)配制50mm、ph值为8.0-9.5的tris-hcl缓冲液；

70、2)将终浓度为0.1～4mm的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)加入步骤1)所述的缓冲液中，混匀，2～4℃避光保存；

71、所述化学发光底物b液：

72、1)配制50mm、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液；

73、2)将终浓度为0.5～0.7mm的氢氧化钠、1.42mm的十二烷基硫酸钠、50～500mm的2-氨基-2-甲基-1-丙醇，1～10mm的mgcl，0.01-0.1％(v/v)防腐剂加入到1000ml步骤1)所述的缓冲液中，混匀，2～4℃保存；

74、使用方法：使用前将a液与b液按1∶1(v/v)比例混合后使用。

75、(3)适用于吖啶酯标记的热休克蛋白90α单克隆抗体2的发光底物a和b液的配置如下：

76、所述化学发光底物a液：

77、1)配制50mm、ph值为8.0-9.5的tris-hcl缓冲液；

78、2)将终浓度为0.1～4mm的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)加入步骤1)所述的缓冲液中，混匀，2～4℃避光保存；

79、所述化学发光底物b液：

80、1)配制50mm、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液；

81、2)将终浓度为0.5～0.7mm的氢氧化钠、1.42mm的十二烷基硫酸钠、50～500mm的2-氨基-2-甲基-1-丙醇，1～10mm的mgcl，0.01-0.1％(v/v)的防腐剂加入到1000ml步骤1)所述的缓冲液中，混匀，2～4℃保存；

82、使用方法：使用前将a液与b液按1∶1(v/v)比例混合后使用。

83、进一步，所述分析物稀释液是用下述方法制备：

84、将20mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液中依次加入终浓度为150mm的nacl，0.5mg/ml的酪蛋白钠，10％甘油(v/v)，10％新生牛血清(v/v)，0.01-0.5％吐温20(v/v)，0.01-0.5％proclin300(v/v)，每加入一种试剂都充分搅拌均匀。

85、进一步，所述洗涤液是用下述方法制备：

86、取6.05g三羟甲基氨基甲烷、8.55g的nacl、0.5ml的tween-20，加去离子水1000ml，溶解后用hcl调ph至7.5。

87、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

88、本发明试剂盒可以检测病人血清、血浆和全血中热休克蛋白90α的含量，对于非小细胞肺癌及其它肿瘤的检测具有重要的指导意义，与传统的elisa方法相比，本发明的试剂盒灵敏度度高，特异性强，安全可靠。