快速检测N末端B型脑钠肽的均相免疫试剂盒、制备方法、检测方法和装置与流程

本发明属于免疫分析，具体涉及一种快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫试剂盒、制备方法、检测方法和装置。

背景技术：

1、n末端b型脑钠肽即n-terminal probnp(nt-probnp)，是心室肌过度扩张时分泌的probnp(108个氨基酸残基)在转化酶依赖反应中产生的无活性n末端部分，由76个氨基酸组成。n末端b型脑钠肽相对分子质量约为8.5kd，由肾脏清除，半衰期为90-120分钟，体外稳定，血液中浓度高，为bnp的15-20倍。在健康人的外周血中，n末端b型脑钠肽的含量很低，当因容量负荷引起心室压力的改变以及室壁张力的增加时，心室肌细胞就会合成和分泌bnp及n末端b型脑钠肽，因此n末端b型脑钠肽浓度升高能很好地反映心室结构和功能的改变。目前，n末端b型脑钠肽已被公认为心功能紊乱时敏感和特异的指标，临床上主要用于心力衰竭的辅助诊断。

2、对于n末端b型脑钠肽的检测法，不论放射免疫分析(ria)、酶免疫分析(eia)，还是化学发光免疫分析，由于标记抗体为过量，检测前均需要去除未参加反应的标记抗体。现有非均相免疫分析法都需要繁琐的洗涤步骤；同时，需要克服放射免疫分析环境污染，货架期短的缺陷，克服酶免疫分析重复性差等缺陷。

3、均相免疫分析技术中无需分离洗涤步骤，然而基于均相免疫的生物检测中，通过缩短检测时间，来进一步提高检测效率时，由于反应未达平衡，会严重影响检测的各项性能，例如：检测灵敏度会显著下降。另外，单线态氧离子寿命太短限定了光激化学发光技术应用效率，目前尚无显著增加其寿命的报道，而增加其寿命就可以提高同等条件下的检测信号，可以增加检测灵敏度，降低检测限。

4、因此，亟待建立一种快速、准确、灵敏的检测n末端b型脑钠肽的均相免疫方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种制备快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫试剂盒的方法，由该方法获得的试剂盒能够快速检测待测样本中的n末端b型脑钠肽，检测时间可缩短至12min以内，但同时检测灵敏度却能达到5pg/ml，还克服了与参比试剂相关性差的缺陷。

2、为此，本发明第一方面提供了一种制备快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫试剂盒的方法，其包括：

3、制备组分a，所述组分a为与第一抗体或其结合片段结合的能够与活性氧反应生成可检测信号的受体；所述第一抗体或其结合片段能够与n末端b型脑钠肽的第一表位特异性结合；

4、制备组分b，所述组分b为与生物素结合的第二抗体或其结合片段；所述第二抗体或其结合片段能够与n末端b型脑钠肽的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠；

5、制备组分c，所述组分c为与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生活性氧的供体。

6、在本发明的一些实施方式中，所述的第一抗体和第二抗体分别独立地选自单克隆抗体、多克隆抗体、人工抗体或修饰的抗体；优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体；进一步优选为单克隆抗体。

7、在本发明的一些实施方式中，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒。

8、在本发明的另一些实施方式中，所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒。

9、在本发明的一些实施方式中，所述第一抗体或其结合片段与受体间接结合；优选地，所述第一抗体或其结合片段与受体通过硫氰酸荧光素-异硫氰酸荧光素抗体系统(fitc-fitc抗体系统)间接结合。

10、在本发明的另一些实施方式中，所述受体为醛基和/或羧基改性的受体；优选地，所述受体为羧基改性的受体。

11、根据本发明，所述方法还包括：

12、制备第一组合物，所述第一组合物包括所述组分a和第一缓冲液；

13、制备第二组合物，所述第二组合物包括所述组分b和第二缓冲液；

14、制备第三组合物，所述第三组合物包括所述组分c和第三缓冲液。

15、在本发明的一些实施方式中，所述第一组合物中组分a的浓度为50～300μg/ml；优选为80～250μg/ml；更优选为100～200μg/ml；和/或，

16、所述第二组合物中组分b的浓度为1～15μg/ml；优选为2～10μg/ml；更优选为4～8μg/ml；和/或

17、所述第三组合物中组分c的浓度为20～200μg/ml；优选为30～150μg/ml；更优选为50～100μg/ml。

18、在本发明的一些实施方式中，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，且所述第一组合物的制备方法包括：

19、步骤s1，第一抗体或其结合片段利用第一透析缓冲液进行透析，获得透析后的第一抗体或其结合片段；

20、步骤s2，用交联缓冲液对受体进行清洗后，再用交联缓冲液对清洗后的受体重悬，获得受体液；

21、步骤s3，在受体液中加入透析后的第一抗体或其结合片段混匀，进行结合，获得与第一抗体或其结合片段结合的受体；

22、步骤s4，用清洗缓冲液对与第一抗体或其结合片段结合的受体进行清洗后，加入第一缓冲溶液获得第一组合物。

23、在本发明的一些实施方式中，所述第一抗体或其结合片段与受体的质量比为(0.1～0.9):10；优选地，所述第一抗体或其结合片段与受体的质量比为(0.2～0.8):10；更优选为(0.3～0.7):10。

24、在本发明的另一些实施方式中，所述第一透析缓冲液和交联缓冲液均为ph值为9.5～10.0的0.03～0.08m的cb缓冲液；所述清洗缓冲液为ph值为7.0～7.5的0.08～0.12m的pbst缓冲液。

25、根据本发明，所述第二组合物的制备方法包括：

26、步骤t1，第二抗体或其结合片段利用标记缓冲液进行透析，获得透析后的第二抗体或其结合片段；

27、步骤t2，在透析后的第二抗体或其结合片段中加入标记缓冲液混匀，然后加入生物素物溶液混匀，旋转过夜，获得与第一标记物结合的第二抗体或其结合片段；

28、步骤t3，与第一标记物结合的第二抗体或其结合片段利用第二透析缓冲液进行透析，透析结束后加入第二缓冲液，获得第二组合物。

29、在本发明的一些实施方式中，所述标记缓冲液为ph值为7.5～8.5的0.08～0.12m的nahco3溶液；所述第二透析缓冲液为ph值为7.0～7.5的0.08～0.12m的pbs缓冲液。

30、在本发明的另一些实施方式中，所述第一标记物与第二抗体或其结合片段的质量比为1:(1～10)；优选地，所述第一标记物与第二抗体或其结合片段的质量比为1:(1～5)。

31、根据本发明，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为ph值为7.0～8.0的0.08～0.12m的tris-hcl溶液。

32、在本发明的一些实施方式中，所述第三组合物中还包含表面活性剂；优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂；进一步优选地，所述表面活性剂为直链型非离子表面活性剂。

33、在本发明的另一些实施方式中，所述表面活性剂的浓度为0.01-0.04wt％；优选为0.02-0.04wt％。

34、本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的方法制备得到的快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫试剂盒。

35、本发明第三方面提供了一种采用如本发明第二方面所述的试剂盒快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫方法，所述方法为光激化学发光检测。

36、根据本发明，所述方法包括以下步骤：

37、步骤r1，将v1体积待测样本与v2体积第一组合物和v3体积第二组合物混合后进行第一反应，得到第一混合物；所述第一反应的温度为k1，时间为t1；

38、步骤r2，将第一混合物与第三组合物混合后进行第二反应，得到第二混合物；所述第二反应的温度为k2，时间为t2；

39、步骤r3，利用能量或者活性化合物激发第二混合物中的供体产生活性氧，所述受体能够与接收到的活性氧反应生成可检测的化学发光信号；通过检测化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样本中是否存在n末端b型脑钠肽和/或确定n末端b型脑钠肽的含量；

40、其中，t1≤15min，t2≤5min，且t1+t2≤15min。

41、在本发明的一些实施方式中，步骤r1中，先将待测样本与所述第一组合物混合后再加入第二组合物。

42、在本发明的另一些实施方式中，所述k1和k2分别独立地选自35～45℃；优选选自37～42℃。

43、在本发明的一些实施方式中，所述t1≤15min；优选地，所述t1≤13min；进一步优选地，6min≤t1≤10min。

44、在本发明的另一些实施方式中，所述t2≥2min。

45、在本发明的一些实施方式中，所述t1+t2≤15min；优选地，所述t1+t2≤13min；进一步优选地，所述t1+t2≤12min。

46、在本发明的另一些实施方式中，所述t1为10min，t2为2min。

47、在本发明的一些实施方式中，5μl≤v1≤100μl；优选地，10μl≤v1≤80μl；更优选地，20μl≤v1≤60μl。

48、在本发明的另一些实施方式中，5μl≤v2≤50μl；优选地，8μl≤v2≤40μl；更优选地，10μl≤v2≤25μl。

49、在本发明的一些实施方式中，5μl≤v3≤50μl；优选地，8μl≤v3≤40μl；更优选地，10μl≤v3≤25μl。

50、在本发明的另一些实施方式中，步骤r3中，利用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生活性氧，受体与接触到的活性氧反应生成520-620nm的发射光，通过检测发射光信号的存在和/强度，从而判断测待测样本中是否存在n末端b型脑钠肽和/或确定n末端b型脑钠肽的含量。

51、根据本发明，所述方法的灵敏度为5pg/ml。

52、本发明第四方面提供了一种快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫检测装置，其采用如本发明第二方面所述的试剂盒或如本发明第三方面所述的方法检测待测样本中的n末端b型脑钠肽。

53、根据本发明，所述装置包括：加样模块、试剂模块、温育模块、检测模块以及电路控制模块；所述加样模块、试剂模块、温育模块和检测模块均与所述电路控制模块电连接。

54、在本发明的一些实施方式中，所述试剂模块包括用于加入第一组合物的第一组件以及用于加入第二组合物的第二组件。

55、本发明第五方面提供了一种如本发明第二方面所述的试剂盒、如本发明第三方面所述的方法或如本发明第四方面所述的装置在光激化学发光检测技术中的应用。

56、本发明第六方面提供了一种如本发明第一方面所述方法在制备用于检测疑似心力衰竭的受治疗者的待测样本中的n末端b型脑钠肽，由此确定所述待测样本中n末端b型脑钠肽的水平的试剂盒中的应用；优选地，所述待测样本为血浆或血清。

57、本发明的有益效果为：由本发明所述方法制备的快速检测n末端b型脑钠肽的均相免疫试剂盒能够快速检测待测样本中的n末端b型脑钠肽，检测时间可缩短至12min以内，且检测灵敏度能达到5pg/ml、变异系数在10％以内。另外，采用本发明所述试剂盒进行检测时，可以减少试剂的用量、节省原料，且能准确、快速确定受治疗者的待测样本中n末端b型脑钠肽的含量，具有广阔的应用前景。