一种黄曲霉毒素M1快速检测试剂盒及其检测方法

本发明涉及食品检测，具体涉及一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、黄曲霉毒素（afs）是一类具有相似化学结构的二氢呋喃香豆素衍生物。af包括黄曲霉毒素b1（afb1）、黄曲霉素b2（afb2）、黄曲霉毒素g1（afg1）、黄曲霉毒素g2（afg2）和黄曲霉素m1（afm1），它们主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物。此外，afs是主要的真菌毒素，占食品和饮料中真菌毒素污染的近93%。动物摄入被afb1污染的食物或饲料后，afb1在体内通过细胞色素p-448调节作用和氧化酶系统催化而转化为afm1。羟基化代谢物的一部分从尿液和牛奶中排出，另一部分存在于动物的可食用部分。因此，检测牛奶中黄曲霉素m1（afm1）的存在至关重要。目前市场上乳制饮用品受到黄曲霉素m1（afm1）污染较为严重，不合格产品曝光事件被频繁报道。根据近5年web of science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。

2、当前检测黄曲霉素m1（afm1）方法包括高效液相色谱-荧光检测（hplc–fld），超高效液相色谱-串联质谱（uplc-ms/ms）和酶联免疫吸附试验（elisa）。hplc和uplc-ms/ms因高准确度、灵敏度是最常用的检测方法，也是国家标准规定方法，但是存在成本高、耗时、操作繁琐、样品制备和预处理复杂，需要配备精密昂贵仪器和依靠专业操作人员，属于实验室检测方法，不适于现场快速检测。免疫分析法通常是酶联免疫吸附法（elisa）及与其他方法相结合的测定方法，如荧光法、电化学法等。免疫分析法虽然具有高灵敏度和高选择性，但通常酶-底物反应需要较长的反应时间，且因食品基质对抗体和抗原结合有影响，易导致检测结果出现假阳性、假阴性，并且所涉及的抗体和酶具有生产成本高、批次重现性差及储存中易变性等局限性。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的之一是提供一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒，解决生产现场的快速检测目标，具有高灵敏、快速、高选择性和便携等优势。

2、为了实现上述发明目的，具体技术方案如下：

3、本发明提供一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：核酸适配体特异性识别元件（fe3o4@aunps-aptamer）、荧光素（fam）标记的dna链（fam-cdna）、超纯水、检测试纸条；

4、所述核酸适配体基因序列如seq id no.1所示；

5、所述荧光素标记的dna链基因序列如seq id no.2所示，其中是在5′修饰荧光素（fam）。

6、优选地，所述核酸适配体特异性识别元件（fe3o4@aunps-aptamer）的制备方法，包括如下步骤：

7、s11：fe3o4纳米粒子的制备：将fecl3·6h2o与feso4·7h2o按质量比2:1加入至含100 ml超纯水的三口烧瓶中，超声5~10 min使其溶解，在n2气氛下，在温度为80℃下，缓慢滴加40~60 ml nh3·h2o，接着加入0.6 mol/l的40~60 ml柠檬酸钠溶液，300 rpm搅拌速度下反应1 h，用超纯水洗涤粗产物至上清液的ph=7，磁分离后倒掉上清液，将剩余物冻干12h；

8、s12：金纳米粒子（aunps）的制备：向超纯水中加入0.006 mol/l柠檬酸钠溶液和0.1 mol/l氯金酸溶液，磁力搅拌1 min后，迅速加入0.1 mol/l硼氢化钠溶液，待溶液变为酒红色后，继续搅拌10 min，然后于25℃水浴中继续反应2 h，所得溶液放置于4℃冰箱备用；

9、s13：fe3o4@pei纳米粒子的制备：取s11中10 mg的fe3o4纳米粒子与5 mg/ml聚乙烯亚胺溶液（pei）混合，在400~700 rpm机械搅拌5 h，聚乙烯亚胺溶液（pei）在fe3o4纳米粒子上成功自组装，将fe3o4@pei纳米粒子用超纯水洗涤5次备用；

10、s14：fe3o4@aunps纳米粒子的制备：将上述s13制得的fe3o4@pei纳米粒子与上述20ml的s12制得的金纳米粒子（aunps）混合并超声，在40 khz、200 w处理30 min，得到粗产物fe3o4@pei-au纳米粒子，利用磁性分离性能将粗产物用超纯水洗涤3次以去除多余的金纳米粒子（aunps），接着将制得的fe3o4@pei-au纳米粒子分散在0.4 mm的50 ml氯金酸溶液，并迅速加入0.5 ml的100 mg/ml盐酸羟胺，混匀10 min后，添加0.1~0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（k30）并超声处理10 min，最后用超纯水洗涤3次以去除过量的聚乙烯吡咯烷酮（k30），制得fe3o4@aunps纳米粒子，并将其冻干保存备用；

11、s15：核酸适配体特异性识别元件（fe3o4@aunps-aptamer）的制备：将10 mm的三（2-羧乙基）膦、100 μm核酸适配体（aptamer）、ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液（pbs）和超纯水按照体积比1:1:5:5混匀，并于25℃下培养1 h，得到活化的适配体溶液，然后将2.35 mg/ml fe3o4@aunps溶液1~2 ml添加到上述活化的适配体溶液中，并在25℃下振荡16 h，接着添加1%的十二烷基磺酸钠（sds）10 μl，1 m的nacl溶液100 μl进行盐老化，将盐老化后的溶液25℃下摇床振荡24 h后，磁分离反应混合物，并用超纯水洗涤3次，得到核酸适配体特异性识别元件（fe3o4@aunps-aptamer），再将其分散在ph=8.0的ste缓冲液中，并于4℃下储存备用。

12、优选地，所述金纳米粒子（aunps）的粒径为5~6 nm。

13、优选地，所述检测试纸条包括样品垫、底衬板、反应膜和吸水垫；

14、所述反应膜位于中间，所述样品垫和吸水垫分别搭接于反应膜的两端；所述样品垫、吸水垫和反应膜搭接组装于底衬板上；所述反应膜上设置检测线t线和质控线c线，所述检测线t线靠近样品垫，所述质控线c线靠近吸水垫，所述质控线c线下方设置有磁条；所述检测线t线喷涂捕获dna链c2-dna，所述捕获dna链c2-dna的基因序列如seq id no.3所示。

15、优选地，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述样品垫为玻璃纤维。

16、基于同一发明构思，本发明的另一目的是提供一种利用黄曲霉毒素m1检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

17、s21：将核酸适配体特异性识别元件（fe3o4@aunps-aptamer）、荧光素（fam）标记的dna链（fam-cdna）按比例加入到超纯水中混合，震荡1 min后，室温下孵育10 min，制备出适配体纳米荧光探针（fe3o4@au-apt-fam-cdna）；

18、s22：将s21制备的适配体纳米荧光探针（fe3o4@au-apt-fam-cdna）加入到待测牛奶样本，混匀、室温孵育5~10 min，制备待测液；

19、s23：定性检测：吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上，静置5 min，当检测线t线在365 nm紫外灯下呈现荧光带，质控线c线呈现紫红色，提示检测结果有效，形成阳性检测结果；当无黄曲霉毒素m1（afm1）时，仅质控线c线呈现紫红色，提示检测结果为阴性；

20、s24：定量检测：吸取待测液滴加到检测试纸条的样品垫上，静置5 min，当检测线t线在365 nm紫外灯下呈现荧光带，质控线c线呈现紫红色，提示检测结果有效，形成阳性检测结果；使用荧光读数仪测定检测线t线荧光带强度，测定出待测液中黄曲霉毒素m1（afm1）含量。

21、优选地，所述核酸适配体特异性识别元件（fe3o4@aunps-aptamer）和荧光素（fam）标记的dna链（fam-cdna）的浓度比为5:2。

22、优选地，所述适配体纳米荧光探针（fe3o4@au-apt-fam-cdna）和待测牛奶样本的体积比为9:1。

23、本发明上述一个或多个技术方案具有如下技术效果：

24、本发明所提供的黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好，检测限为0.20 ng/ml，回收率在99％~101％，检测结果准确，能够无需样品前处理直接进行黄曲霉毒素m1（afm1）的检测。检测黄曲霉毒素m1（afm1）的核酸薄膜层析检测试纸条具有识别/分离双功能，因而特异性强、灵敏度高、操作简便且无须样品前处理；反应速度快，完成样品的检测操作和数据判读只需10~15 min；检测过程不需要复杂昂贵的仪器设备及较高的专业技术人员操作。