一种马拉硫磷的电化学发光检测方法

本发明涉及一种马拉硫磷(mal)的检测方法，具体涉及一种基于h4tcbpe-tio2的优异ecl特性和点击化学驱动的tdtase策略的电化学发光检测mal的方法，属于分析检测。

背景技术：

1、作为农药的重要一类，有机磷农药(ops)已广泛用于农业保护作物免受害虫和杂草的侵害，但有剧毒。在各种ops中，马拉硫磷(s-1,2-双(乙氧基羰基)乙基o，o-二甲基磷硫酸酯，mal)作为典型的杀虫剂，已被证实对人体神经系统产生不利影响，导致麻木、呼吸窘迫、运动等症状不协调和心动过缓，少量的mal也会对人的肝脏产生长期危害。因此，开发高灵敏度的mal检测方法具有重要意义。

2、对于mal的常用检测方法包括气相色谱法、气相色谱-质谱、高效液相色谱及液相色谱-质谱法。这些方法中的大多数涉及高贵的设备、专业的操作员和样品制备繁琐，无法实现低成本和快速的mal检测。因此，迫切需要开发一种快速、灵敏的mal检测方法。

3、与传统检测方法相比，电化学发光(ecl)是一种新颖的检测方法，ecl具有低背景、灵敏度高、可控性强等独特优势受到广泛关注，其ecl信号源自电极表面电活性物质之间的电子转移。h4tcbpe扭曲的非共面配置可以阻止荧光量子产率和ecl效率的降低，将其与mofs结合制备的材料虽然有更强的ecl信号，但是mofs的中心金属离子不能对提高mofs的ecl信号起有到益的作用。tio2具有良好的光电性能及化学稳定性，tio2纳米花因其大的表面积良好的催化性能而广泛用于新兴ecl发光体中。文献(tu,t.-t.；sun,y.；lei,y.-m.；chai,y.-q.；zhuo,y.；yuan,r.,nanoscale 2022,14(15),5751-5757.)中使用tio2作为共反应促进剂来促进s2o82-的还原，从而提高了ecl强度。但到目前为止，还未见h4tcbpe-tio2纳米球结合点击化学驱动的tdtase信号放大技术构建用于mal测定的ecl生物传感器相关报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种电化学发光检测mal的方法，该方法基于h4tcbpe-tio2的优异ecl特性，巧妙设计了点击化学驱动的tdtase策略，以实现对mal的高灵敏度、高选择性的电化学发光检测。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供了一种马拉硫磷的电化学发光检测方法，该方法包含以下步骤：

3、1)将p1、p2及马拉硫磷适体置于缓冲溶液中进行无铜点击反应，再加入马拉硫磷溶液进行孵育ⅰ，得到含马拉硫磷适体-马拉硫磷复合物及单链探针p1-p2的混合物；所述p1为二苯并环辛炔修饰的dna1；所述p2为叠氮修饰的dna2；

4、2)将h4tcbpe-tio2纳米球、纳米银粒子及发夹dna依次滴加至gce电极表面进行孵育ⅱ，形成复合电极；

5、3)在所述复合电极表面，先滴加所述混合物进行孵育ⅲ，再滴加末端脱氧核苷转移酶触发tdtase延伸反应，再滴加sa-pfc进行孵育ⅳ后，通过ecl测试得到复合电极的ecl强度响应值；

6、4)将不同浓度的标准马拉硫磷溶液按步骤1)～3)进行操作，得到一系列ecl强度响应值，并构建马拉硫磷浓度对数与ecl强度响应值之间的标准曲线；

7、5)将待测马拉硫磷溶液按步骤1)～3)进行操作，获得相应ecl强度响应值，并根据标准曲线计算待测马拉硫磷溶液的浓度。

8、本发明技术方案的关键是在于构建具有电化学发光的生物传感器，其具体的构建原理为：先利用二苯并环辛炔修饰的dna1(p1)、叠氮修饰的dna2(p2)、马拉硫磷适体(mal-apt)经过无铜点击反应形成核酸杂交链，当有目标物马拉硫磷(mal)存在时，mal能够与mal-apt结合成复合物，同时释放出核酸链p1-p2。将h4tcbpe-tio2与纳米银粒子(ag nps)沉积在gce电极上，可以获得初始的强ecl信号；再将发夹dna(h1)修饰在电极上后，探针p1-p2与h1通过杂交结合在一起被固定在电极上，而探针p1-p2可以触发末端脱氧核苷转移酶(tdtase)催化进行tdtase延伸反应，tdtase延伸反应完成后，探针p1-p2与h1杂交形成的双链上会产生像长尾一样的延伸部分，而sa-pfc将被延伸部分捕获，sa-pfc能够猝灭ecl信号，从而导致ecl强度降低。基于ecl强度与mal浓度的对数在一定范围内呈线性关系，从而可以实现对mal的电化学发光检测。

9、作为一个优选的方案，所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲溶液。tris-hcl缓冲溶液具体包含以下成分：50mm kcl，1mm mgcl2，0.01％ tween-20，ph＝7.4)中进行。

10、作为一个优选的方案，所述p1和p2的摩尔比例为1:0.9～1.1，p1和p2的理论反应摩尔比为1:1。所述p1与马拉硫磷适体的摩尔比为1:1.9～2.1。

11、作为一个优选的方案，所述无铜点击反应的条件为30～40℃温度下，反应0.5～1.5小时。点击反应允许核酸序列的连接，且连接效率高。p1、p2与mal-apt杂交成双链，但此时p1的3’端与p2的5’端没有连在一起，而p1、p2序列之间可以利用二苯并环辛炔与叠氮基之间进行点击反应，从而使得双链上的p1与p2连接起来，当mal存在时，则会产生mal-apt与mal复合物及单链探针p1-p2的混合物。

12、作为一个优选的方案，所述孵育i的条件为：在30～40℃温度下，反应0.5～1.5小时。在mal作用下，mal与mal-apt结合在一起形成复合物，同时释放出探针p1-p2。

13、作为一个优选的方案，所述h4tcbpe-tio2纳米球与纳米银粒子的质量比为1:0.3～0.5。

14、作为一个优选的方案，所述发夹dna与p1的摩尔比为3.8～4.2:1。

15、作为一个优选的方案，所述孵育ii的条件为：温度为20～30℃，时间为4～8小时。通过孵育，h4tcbpe-tio2纳米球沉积在gce表面构建h4tcbpe-tio2/gce，再通过ag nps利用ag-s键将h1组装到agnps/h4tcbpe-tio2/gce的表面上。

16、作为一个优选的方案，所述p1的dna序列为：5'-aat tca gat aag cca aca ccagca-dbco-3'。

17、作为一个优选的方案，所述p2的dna序列为：5'-n3-gtc aag tta aga gaa ccatca ccc a-3'。

18、本发明的p1和p2序列的特殊之处是在于p1的序列中修饰有dbco(二苯并环辛炔)基团，而p2的序列中修饰有n3(叠氮基团)，p1、p2与mal-apt杂交成双链，但此时p1的3’端与p2的5’端没有连在一起，而p1、p2序列之间可以利用二苯并环辛炔与叠氮基之间进行点击反应，从而使得双链上的p1与p2连接起来，当mal存在时，则会产生mal-apt与mal复合物及单链探针p1-p2的混合物。

19、作为一个优选的方案，所述发夹dna的序列为：5'-agg gcg ggt tta gtc aag atggag。发夹dna能与单链探针p1-p2经过碱基互补配对形成双链。

20、作为一个优选的方案，所述马拉硫磷适体的dna序列为：5'-atc cgt cac acc tgctct tat aca caa ttg ttt ttc tct taa ctt gac tgc tgg tgt tgg ctc ccg tat-3'。

21、作为一个优选的方案，所述孵育iii的条件为：温度为30～40℃，时间为60～90min。通过孵育将发夹dna(h1)与探针p1-p2通过杂交结合并一起被固定在电极上。

22、作为一个优选的方案，所述tdtase延伸反应的条件为：温度为30～40℃，时间为40～80min。tdtase延伸反应主要是利用探针p1-p2可以触发末端脱氧核苷转移酶(tdtase)催化进行tdtase延伸反应，在探针p1-p2与h1杂交形成的双链上产生一小段延伸部分，用于捕获sa-pfc。

23、作为一个优选的方案，所述孵育iv的条件为：温度为20～30℃，时间为20～30min。通过孵育实现对sa-pfc结合。

24、作为一个优选的方案，所述h4tcbpe-tio2纳米球通过以下方法制备得到：将钛酸四丁酯溶于n,n-二甲基甲酰胺和异丙醇混合溶剂中，再加入h4tcbpe在180～220℃温度下进行溶剂热反应18～24小时，即得。更具体的制备方法如下：将10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)和30ml异丙醇(ipa)混合并在室温下搅拌10分钟，再加入1ml钛酸四丁酯(ti(oc4h9)4)至将上述混合物继续搅拌30分钟，直到形成均匀的溶液。再加入20mg h4tcbpe在180～220℃温度下进行溶剂热反应18～24小时，即得。利用h4tcbpe作为模板制备的h4tcbpe-tio2纳米球具有特殊的多孔结构，可以更有效地聚集丰富的h4tcbpe配体，更进一步提高了ecl发射体的利用率。充当ecl共反应促进剂的tio2促进了共反应剂s2o82-向so4·-的转化，增强了ecl强度。

25、作为一个优选的方案，所述ecl测试的条件：电解液为含k2s2o8的pbs溶液，具体为含10mm k2s2o8的0.1m pbs溶液，测试电压为-2.0v至0v。作为一个较优选的方案，ecl数据采集的扫描速率为300mv/s，光电倍增管的(pmt)的电压为800v。

26、本发明采用的h4tcbpe-tio2纳米球能够明显提高ecl信号强度。所述h4tcbpe-tio2纳米球通过以下方法制备得到：将10ml n，n-二甲基甲酰胺(dmf)和30ml异丙醇(ipa)混合并在室温下搅拌10分钟。再加入1ml钛酸四丁酯(ti(oc4h9)4)至将上述混合物继续搅拌30分钟，直到形成均匀的溶液。20mg h4tcbpe加入所得溶液中，然后搅拌2小时后，混合物被转移到高压灭菌器中加热至200℃，加热20小时。冷却后，所得产物离心并用水和乙醇洗涤三次。最后，将产品在70℃真空干燥24小时以获得h4tcbpe-tio2纳米球。

27、本发明采用的银纳米粒子(ag nps)通过以下方法制备得到：在剧烈搅拌作用下，将agno3水溶液和柠檬酸钠水溶液加入水中；再将nabh4溶液快速加入反应，即得ag nps。更具体的制备方法如下：剧烈搅拌下将25μl agno3水溶液(0.1m)和25μl c6h5na3o7水溶液加入装有10ml超纯水的烧瓶中；将600μl新鲜制备的nabh4水溶液(5mm)快速加入到上述混合物中。将所得溶液搅拌30分钟以获得亮黄色的ag nps，然后储存在4℃的冰箱中。

28、本发明采用的sa-pfc通过以下方法制备得到：将fcda超声溶解在甲醇中后，暴露在自然光下1～3小时，再进行离心、洗涤和干燥，所得固体产物超声分散至水中，再加入nhs和edc反应30min～60min，再加入sa，在低于5℃温度下反应18～30小时。更具体的sa-pfc合成方法如下：将20mg fcda超声溶解在20ml甲醇中以获得橙色溶液，将混合物暴露在自然光下2小时，溶液的颜色从橙色变为灰褐色，沉淀用甲醇离心洗涤3次，并在60℃真空干燥，将所得产物通过超声分散到1ml超纯水中。之后，将11mg nhs和15mg edc加入溶液中并搅拌45分钟。接下来，将100μl sa(1mg/ml)注入混合溶液中，然后在4℃下搅拌24小时。最后，通过离心收集所得的sa-pfc并在0.1m pbs中重新分散。

29、本发明制备含马拉硫磷适体-马拉硫磷复合物及探针p1-p2的混合物的方法，具体如下：反应体系在tris-hcl缓冲溶液(50mm kcl,1mm mgcl2,0.01％tween-20,ph 7.4)中进行，所有dna链(p1、p2、mal-apt及mal)用tris-hcl缓冲溶液配制成相应浓度的溶液(具体配制方法及用量在购买的试管瓶身)。将配好的p1、p2和mal-apt(p1体积为5μl，浓度为1μm；p2体积为5μl，浓度为1μm；mal-apt的体积为10μl，浓度为1μm)混合，然后在37℃下孵育1小时，以形成mal-apt/p1-p2双链体。再加入10μl不同浓度的mal与上述混合物反应，温度为37℃，时间为1小时。在此过程中，mal-apt与mal结合会产生复合物，探针p1-p2被释放出来。即得到含mal-apt与mal形成的复合物及探针p1-p2的混合物。

30、本发明的ecl传感器的构建方法：将10μl h4tcbpe-tio2纳米球沉积在gce表面上以获得h4tcbpe-tio2/gce。随后，将10μl已制备的ag nps滴到h4tcbpe-tio2涂层上。将10μl h1(2μm)在修饰的电极上于25℃孵育6小时，通过ag-s键将h1组装到agnps/h4tcbpe-tio2/gce的表面上，并用0.1m pbs(ph 7.4)冲洗以去除未组装的h1。将10μl在无铜点击核酸连接反应中获得的混合物滴在电极上，并在37℃下保持75分钟。电极上的h1与探针p1-p2杂交结合，用pbs溶液洗涤后，在37℃下加入20μl混合溶液(含有1μl tdtase，5μl biotin-datp，1μl cocl2，5μl tdtase反应缓冲液和8μl超纯水)反应60分钟，用于tdtase介导的延伸反应。加入10μl sa-pfc，并在25℃的湿润条件下孵育25分钟。最后，用pbs溶液冲洗所得电极。

31、本发明通目标物(mal)与mal-apt结合，同时释放出探针p1-p2。探针p1-p2与gce电极上的h1杂交结合成双链被固定在电极表面，并触发tdtase延伸反应，tdtase延伸反应完成后，探针p1-p2与h1杂交结合成的双链将形成像长尾一样的延伸部分，sa-pfc将被延伸部分捕获，sa-pfc能够猝灭ecl信号，导致ecl强度降低。mal浓度越大ecl强度越弱，ecl强度与mal浓度的对数在一定范围内呈线性关系，从而对目标物mal进行定量。

32、本发明的电化学发光检测中，在含有0.1mm k2s2o8的pbs(ph 7.4)溶液中，在-2.0v至0v的电压范围内进行ecl测量。以300mv/s的扫描速率和电压为800v的光电倍增管(pmt)进行ecl数据采集。

33、本发明技术方案合成了h4tcbpe-tio2纳米球，通过具有多孔结构的tio2可以有效地聚集丰富的h4tcbpe配体，提高了ecl发射体的利用率。充当ecl共反应促进剂的tio2促进了共反应剂s2o82-向so4·-的转化，增强了ecl强度。应用点击化学驱动的tdtase延伸反应作为一种有效的信号放大策略，提高了操作的便利性。

34、本发明提供的电化学发光检测mal的方法，包含以下具体步骤：

35、(1)无铜点击核酸连接反应识别mal：反应体系在tris-hcl缓冲溶液(50mm kcl，1mm mgcl2，0.01％ tween-20，ph 7.4)中进行，所有dna链(p1、p2、mal-apt及mal)用tris-hcl缓冲溶液配制成相应浓度的溶液(具体配制方法及用量在购买的试管瓶身)。将配好的p1、p2和mal-apt(p1体积为5μl，浓度为1μm；p2体积为5μl，浓度为1μm；mal-apt的体积为10μl，浓度为1μm)混合，然后在37℃下孵育1小时，以形成mal-apt/p1-p2双链体。将10μl不同浓度的mal与上述混合物反应，温度为37℃，时间为1小时。在此过程中，mal-apt与mal结合会产生复合物，探针p1-p2被释放出来，得到含mal-apt与mal的复合物及探针p1-p2的混合物。

36、(2)电化学发光生物传感器的构建：将h4tcbpe-tio2纳米球沉积在gce表面上以获得h4tcbpe-tio2/gce。随后，将已制备的ag nps滴到h4tcbpe-tio2涂层上。通过ag-s键将h1(2μm)组装到agnps/h4tcbpe-tio2/gce的表面上，再用pbs溶液洗去多余的h1。将10μl在无铜点击核酸连接反应中获得的混合物滴在电极上，并在37℃下保持75分钟。用pbs溶液洗涤后，在37℃下加入20μl混合溶液(含有1μl tdtase，5μlbiotin-datp，1μl cocl2，5μltdtase反应缓冲液和8μl超纯水)反应60分钟，用于tdtase延伸反应。加入10μl sa-pfc，并在25℃的潮湿条件下孵育25分钟。最后，用pbs溶液冲洗所得电极。延伸反应完成后，加入sa-pfc，sa-pfc将被延伸部分捕获，能够猝灭ecl信号，导致ecl强度降低。mal浓度越大ecl强度越弱。重复以上操作，即可根据ecl强度对标准样浓度的对数绘制标准曲线，用待测液代替mal标准溶液进行上述检测，通过标准曲线获得浓度结果。

37、相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

38、1)本发明采用的h4tcbpe-tio2纳米球，其利用具有多孔结构的tio2可以有效地聚集丰富的h4tcbpe配体，更进一步提高ecl发射体的利用率，充当ecl共反应促进剂的tio2促进了共反应剂s2o82-向so4·-的转化，增强ecl强度。

39、2)本发明通过mal-apt、p1与p2的碱基互补配对和无铜点击核酸连接反应，mal与mal-apt结合成混合物，同时产生探针p1-p2，无铜点击核酸连接反应的连接效率高并巧妙地利用tdtase延伸反应产生的延伸部分末端来捕获sa-pfc，以实现猝灭ecl信号，导致ecl强度降低，mal浓度越大ecl强度越弱，从而构建mal浓度与ecl信号的关系。

40、3)本发明通过结合h4tcbpe-tio2良好的ecl特性及点击化学驱动的tdtase放大策略，以实现对mal的高灵敏ecl检测。

41、4)本发明构建的用于mal的信号增大型电化学发光传感策略，在0.001-100ng/ml浓度范围内，ecl强度与目标物浓度对数存在良好的线性关系，具有线性范围宽、检测线低的优点。