一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法和应用与流程

本发明属于血浆检测，尤其涉及一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法和应用。

背景技术：

1、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,pcc)和副神经节瘤(paraganglioma,pgl)是具有激素分泌功能的神经内分泌肿瘤，主要合成、分泌和释放大量儿茶酚胺(ca)，如肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺，引起患者血压升高和代谢性改变等一系列临床症，并造成心、脑、肾血管等严重并发症甚至成为患者死亡的主要原因，在普通高血压门诊中患病率为0.2％～0.6％，在儿童高血压患者中为1.7％。pcc和pgl合称为嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(ppgl)。ppgl患者的主要临床表现为儿茶酚胺(catecholamine，ca)类物质分泌增多，ca是一类含有儿茶酚和胺基的神经类物质，是人体内重要的神经递质和激素，包括肾上腺素(e)、去甲肾上腺素(ne)和多巴胺(da)。ca在儿茶酚-o-甲基转移酶(comt)的作用下生成变肾上腺素类物质(metanephrines，mns)，主要包括变肾上腺素(mn)、去甲变肾上腺素(nmn)和3-甲氧酪胺(3-mt)。《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识(2020)》中推荐：诊断ppgl的实验室检查首选血浆游离或尿液甲氧基肾上腺素(mn)、变肾上腺素浓度测定；建议：可同时检测血或尿ne、e、da及其他代谢产物3-mt等浓度以帮助诊断。

2、但是儿茶酚胺及其代谢物的极性较大、结构相近，而且在血浆中含量较低、干扰较大，传统的免疫法不能准确定量，而常用化学发光法、荧光法和高效液相色谱法等存在血浆样品前处理过程复杂，所需起始样品量较大，检测过程时间长，实验误差较大，通量低，特异性较差，无法准确区分结构相似的肾上腺素和去甲变肾上腺素等问题。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，该检测方法能够快速而准确地检测出血浆中的3种儿茶酚胺代谢物mn、nmn和3-mt，操作简便且结果可靠。

2、为达到上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法：对待测血浆进行去蛋白和衍生化处理后，用高效液相色谱串联质谱法检测其中的儿茶酚胺代谢物，所述高效液相色谱的色谱条件为：

4、色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

5、流动相a为含有0.05％～0.15％v/v甲酸的1～3mmol/l乙酸铵水溶液，流动相b为含有0.05％～0.15％v/v甲酸的乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：

6、

7、流速：0.4～0.5ml/min；

8、柱温：35～45℃。

9、相对于现有技术而言，本发明采用液质联用分析方法中的色谱条件在4分钟内即可实现目标儿茶酚胺代谢物之间及其与其他成分之间的分离，使该检测方法的实施过程简单而快速，且上述液相色谱条件具有较高的准确度、精密度和灵敏度，线性范围覆盖临床检测所需要的定量范围。该检测方法的检测结果可用于辅助诊断患者的ppgl和ph，对于临床应用具有重要意义，还可用于研究药代动力学以及药物的组织分布情况等非诊断目的的研究。

10、结合第一方面，所述儿茶酚胺代谢物包括变肾上腺素、去甲变肾上腺素和3-甲氧基酪胺。

11、结合第一方面，所述色谱柱优选采用waters acquitybeh c18色谱柱，规格为2.1×50mm，1.7μm。

12、结合第一方面，流动相a为含有0.1％v/v甲酸的2mmol/l乙酸铵水溶液，流动相b为含有0.1％v/v甲酸的乙腈，利用该流动相能够获得更好的峰形，且响应最强。

13、结合第一方面，流速为0.5ml/min。在本发明的色谱条件下，当流速为0.5ml/min时，出峰时间较早，峰形较好，响应更强。

14、结合第一方面，柱温为40℃。在本发明的色谱条件下，柱温为40℃时响应更强。

15、结合第一方面，所述高效液相色谱串联质谱法中，质谱条件为：

16、电离模式：esi+；

17、雾化器流速：3l/min；

18、加热器流速：10l/min；

19、干燥器流速：10l/min；

20、加热模块温度：400℃；

21、dl管温度：250℃；

22、离子源温度：300℃；

23、扫描模式：mrm。

24、结合第一方面，对血浆进行衍生化处理的操作包括：

25、将待测血浆去除蛋白后，加入丹磺酰氯溶液和ph为9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，混合后在30～70℃衍生化5～30min，然后加入4％～6％v/v甲酸水溶液，混合后离心，取上清液。

26、经丹磺酰氯衍生化后，待测成分的极性和离子化效率得以改善，在反相色谱柱上能与干扰物很好分离，且检测灵敏度能很好地满足要求，仅需要200μl血浆作为起始材料即可满足上述检测，与传统检测方法相比，大大减少了所需的血液量。

27、优选地，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的ph为9.5～11。使用该ph的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液能够在检测时获得更高的响应强度。最优选的ph为9.5。

28、优选地，所述衍生化的时间为15min。在该衍生化时间下，能够获得更高的响应强度。

29、优选地，所述衍生化的温度为60℃。

30、结合第一方面，采用溶剂标准曲线定量法计算血浆中儿茶酚胺代谢物的含量。儿茶酚胺及其代谢物是内源性化合物，目前没有儿茶酚胺及其代谢物的空白血浆可以购买，而常用的替代基质牛血清蛋白中也能检测到儿茶酚胺代谢物，所以本方案优选采用溶剂标准曲线定量法。

31、优选地，用于生成所述溶剂标准曲线的溶液为所述儿茶酚胺代谢物溶液，其溶剂为含维生素c的甲醇水溶液。进一步优选地，维生素c的浓度为5mg/ml，甲醇水溶液的浓度为50％～90％v/v。

32、第二方面，本发明提供了上述检测方法在儿茶酚胺药代动力学研究中的应用。

33、第三方面，本发明提供了上述检测方法在儿茶酚胺组织分布情况研究中的应用。

技术特征：

1.一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，对待测血浆进行去蛋白和衍生化处理后，用高效液相色谱串联质谱法检测其中的儿茶酚胺代谢物，所述高效液相色谱的色谱条件为：

2.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，所述儿茶酚胺代谢物包括变肾上腺素、去甲变肾上腺素和3-甲氧基酪胺。

3.根据权利要求2所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为waters acquitybeh c18色谱柱，规格为2.1×50mm，1.7μm；和/或

4.根据权利要求2所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法中，质谱条件为：

5.根据权利要求1～4任一项所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，对血浆进行衍生化处理的操作包括：将待测血浆去除蛋白后，加入丹磺酰氯溶液和ph为9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，混合后在30～70℃衍生化5～30min，然后加入4％～6％v/v甲酸水溶液，混合后离心，取上清液。

6.根据权利要求5所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，所述碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的ph为9.5～11；和/或

7.根据权利要求1或2所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，采用溶剂标准曲线定量法计算血浆中儿茶酚胺代谢物的含量。

8.根据权利要求7所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法，其特征在于，用于生成所述溶剂标准曲线的溶液为所述儿茶酚胺代谢物的溶液，其溶剂为含维生素c的甲醇水溶液。

9.权利要求1～8任一项所述血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法在儿茶酚胺药代动力学研究中的应用。

10.权利要求1～8任一项所述血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法在儿茶酚胺组织分布情况研究中的应用。

技术总结
本发明属于血浆检测技术领域，尤其涉及一种血浆中儿茶酚胺代谢物的检测方法和应用。本发明提供的检测方法首先对待测血浆进行去蛋白和衍生化处理，然后用高效液相色谱串联质谱法对血浆中的儿茶酚胺代谢物进行检测，通过特定的色谱条件，在4分钟内即可实现目标儿茶酚胺代谢物之间及其与其他成分之间的分离，检测过程简单而快速，且该检测方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度，线性范围覆盖临床检测所需要的定量范围，检测结果可用于辅助诊断患者的PPGL和PH，对于临床应用具有重要意义，还可用于研究药代动力学以及药物的组织分布情况等非诊断目的的研究。

技术研发人员：杨悦梅,张利康
受保护的技术使用者：河北三信医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15