腺苷酸环化酶在制备胶体金标记试剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及腺苷酸环化酶在制备胶体金标记试剂中的应用。

背景技术：

1、腹泻是多种病原、多种因素引起的以大便次数增多和大便性状改变为特点的一组疾病，是儿童患病和死亡的主要原因，也是营养不良的重要原因。腹泻通常是胃肠道感染的一种症状，可由多种细菌、病毒和寄生虫引起。引起感染性腹泻的病原体包括细菌、病毒、寄生虫和真菌等。对于细菌型腹泻，各种细菌分泌产生的肠毒素会与肠道上皮细胞刷状缘上的受体结合，激活肠上皮细胞内的腺苷酸环化酸酶系统，使细胞内第二信使camp、cgmp及钙离子增加，聚积在小肠粘膜上皮细胞内，致使隐窝细胞对水、氯和碳酸氢盐分泌增强，同时又抑制绒毛上皮细胞对钠及氯的吸收，甚至可通过神经反射增加小肠细胞释放五羟色胺而增加肠液分泌，引起腹泻。因此，细菌感染时，上皮细胞脱落增加，腺苷酸环化酶活性异常增加，通过检测粪便中脱落的上皮细胞的腺苷酸环化酶活性可以指示腹泻样本中是否存在致病细菌。

2、目前已经报道的检测腺苷酸环化酶活性的方法，包括免疫学法和色谱法，这其中应用最广泛的是放射性免疫分析法、酶联免疫吸附测试技术和高效液相色谱法。作为传统的检测技术他们已经具备优良的选择性以及合适的检测限。除此之外，还包括腺苷酸环化酶的电镜酶细胞化学试验方法，以亚胺二磷酸腺苷(amp-pnp)作为腺苷酸环化酶的底物，借助电镜进行含酶细胞的分布观察。

3、针对腹泻样本的致病细菌检测，主要采用显微镜检配合病原微生物检测及药敏试验，对病原微生物进行培养分离与鉴定，或是基于核酸分子生物学鉴定技术，如16s rrna序列分析技术鉴定病原微生物类型，均可以检测出致病细菌的类型。

4、现有的腺苷酸环化酶检测技术虽然已经具备优良的选择性以及合适的检测限，但大多存在仪器昂贵、样品前处理繁琐、操作过程复杂、存在放射性危害等问题。针对腹泻样本中是否存在致病细菌的临床检测技术，要么操作步骤繁琐，检测费时又滞后，不利于早期诊断；要么试剂和仪器价格昂贵，对实验人员的专业性和操作性要求极高，不适用于基层医院对临床腹泻致病细菌的快速鉴定。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了腺苷酸环化酶在制备胶体金标记试剂中的应用。本发明提供了一种检测腹泻样本中腺苷酸环化酶的试纸条和检测卡的制备方法，具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、安全无害、适合现场检测的优点。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了腺苷酸环化酶在制备胶体金标记试剂中的应用。

4、本发明还提供了胶体金标记试剂，包括：结合有胶体金的腺苷酸环化酶单克隆抗体和/或抗体。

5、在本发明的一些实施方案中，上述胶体金标记试剂中，所述胶体金的粒径为60～80nm。

6、在本发明的一些实施方案中，上述胶体金标记试剂，所述胶体金的粒径为：60nm、65nm、70nm或80nm。

7、在本发明的一些实施方案中，上述胶体金标记试剂，包括：结合有胶体金的腺苷酸环化酶单克隆抗体。

8、在本发明的一些实施方案中，上述胶体金标记试剂，所述结合有胶体金的腺苷酸环化酶单克隆抗体的浓度为1mg/ml。

9、在本发明的一些实施方案中，上述胶体金标记试剂中，所述腺苷酸环化酶单克隆抗体的来源为：郑州伊美诺生物技术有限公司，腺苷酸环化酶单克隆抗体2h11，2022110301。

10、本发明还提供了上述胶体金标记试剂的制备方法包括如下步骤：取所述结合有胶体金的腺苷酸环化酶单克隆抗体与磷酸盐缓冲液混合，获得所述胶体金标记试剂。

11、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为50mm、ph值为7.4。

12、本发明还提供了上述胶体金标记试剂在制备免疫层析试纸中的应用。

13、本发明还提供了免疫层析试纸，包括：样品垫2、结合垫3、检测膜4和吸水垫5；

14、所述结合垫3包被有上述胶体金标记试剂；

15、所述检测膜4的一端与所述结合垫3搭接，另一端与所述吸水垫搭接5；所述检测膜上设有检测区6和质控区7；

16、所述检测区6包被有腺苷酸环化酶单克隆抗体溶液；

17、所述质控区7包被有二抗溶液。

18、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述结合垫包括：玻璃纤维素膜。

19、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述检测膜包括：硝酸纤维素膜。

20、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述腺苷酸环化酶单克隆抗体溶液的浓度为1mg/ml。

21、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述腺苷酸环化酶单克隆抗体溶液中所述腺苷酸环化酶单克隆抗体来源于郑州伊美诺生物技术有限公司，腺苷酸环化酶单克隆抗体8e9，2022110301。

22、本发明还提供了腺苷酸环化酶单克隆抗体溶液的制备方法，包括如下步骤：取腺苷酸环化酶单克隆抗体与tris-hcl缓冲液混合。

23、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，ph值为8.0。

24、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述二抗溶液的浓度为1mg/ml。

25、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述二抗溶液中的所述二抗的来源为抗腺苷酸环化酶单克隆抗体(郑州伊美诺生物技术有限公司,抗腺苷酸环化酶单克隆抗体2h11，2022111501)。

26、本发明还提供了二抗溶液的制备方法，包括如下步骤：取抗腺苷酸环化酶单克隆抗体与tris-hcl缓冲液混合。

27、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述tris-hcl缓冲液的浓度为50mm，ph值为8.0。

28、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸，还包括：底板1；

29、所述检测膜4的一面完全贴装于所述底板1；

30、所述样品垫2的一端贴装于所述底板1，另一端搭接于所述结合垫3上。

31、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述结合垫3的一端贴装于所述底板1，另一端搭接于所述检测膜上4。

32、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述吸水垫5的一端贴装于所述底板1，另一端搭接于所述检测膜4上。

33、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述检测膜4与所述结合垫3的搭接宽度为1～2mm；

34、所述检测膜4与所述吸水垫5的搭接宽度为1～2mm。

35、所述样品垫2与所述结合垫3的搭接宽度为1～2mm。

36、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述检测区6和所述质控区7的间距为10mm。

37、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析试纸中，所述底板1的面积为70mm×8mm；所述样品垫2的面积为20mm×8mm；所述结合垫3的面积为10mm×8mm；所述检测膜4的面积为20mm×8mm；所述吸水垫5的面积为20mm×8mm。

38、本发明还提供了上述免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：

39、s1：取所述胶体金标记试剂喷涂于所述结合垫后，干燥，获得喷涂后的结合垫；

40、s2：取所述腺苷酸环化酶单克隆抗体溶液点膜于所述检测区，取所述二抗溶液点膜于所述质控区，干燥，获得所述检测膜；

41、s3：取所述样品垫、所述喷涂后的结合垫、所述检测膜和所述吸水垫组装，获得所述免疫层析试纸。

42、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法s1和s2中，所述干燥的温度为37℃，时间为2h。

43、本发明还提供了免疫层析检测卡，包括上述免疫层析试纸和/或上述制备方法获得的免疫层析试纸。

44、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析检测卡，还包括：壳体。

45、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析检测卡，所述壳体包括加样区8和观察区9。

46、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析检测卡，所述观察区9可观察到检测区6和质控区7，所述加样区8位于吸水垫5的上方。

47、在本发明的一些实施方案中，上述免疫层析检测卡，所述壳体中加样区8的面积为8mm×5mm；观察区9的面积为18mm×5mm。

48、本发明还提供了上述胶体金标记试剂、上述免疫层析试纸、上述制备方法获得的免疫层析试纸和/或上述免疫层析检测卡在制备检测腹泻样品中腺苷酸环化酶的活性的产品中的应用。

49、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述腹泻样品包括粪便样本。

50、本发明还提供了上述胶体金标记试剂、上述免疫层析试纸、上述制备方法获得的免疫层析试纸和/或上述免疫层析检测卡在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用。

51、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述病原体包括：细菌。

52、本发明提供了腺苷酸环化酶在制备胶体金标记试剂中的应用。

53、本发明的有益效果包括：

54、(1)、使用本发明的方法制备的一种腺苷酸环化酶检测试纸条和检测卡，具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、安全无害、适合现场检测的优点。

55、(2)、本发明的的腺苷酸环化酶检测方法与酶联免疫吸附技术检测腺苷酸环化酶相比，符合率非常高。