一种同时检测畜禽产品中九种呈味核苷酸的试剂盒及方法与流程

本发明属于食品检测领域，涉及一种试剂盒，具体来说是一种同时检测畜禽产品中九种呈味核苷酸的试剂盒及方法。

背景技术：

1、核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多特殊的生理功能。胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)均具有强烈的呈鲜味作用，是已知能产生鲜美可口味道的重要化合物，能增强肉质鲜味。肌苷酸(inosine-5′-monophosphate，imp)是一种单核苷酸，作为atp代谢中产物，天然存在于肌肉中。在食品中又是一种风味物质，能增强肉质鲜味，其增加鲜味的能力比谷氨酸钠强40倍。肌苷酸作为鲜味物质，主要是由于肌苷酸与谷氨酸钠之间有强烈的正相关，肌苷酸和谷氨酸钠以1：5至1：20的比例混合谷氨酸钠的鲜味可增至数倍，并且对酸、苦味有控制作用，即有味觉缓冲作用。其作用机理是由于核苷酸把金属离子从鲜味感觉部位上除去，而使谷氨酸钠在味觉神经上有效的作用。

2、畜禽产品中肌苷酸含量不仅受到其品种、年龄、部位等自身因素的影响，还受屠宰日龄、屠宰方法、肌肉贮藏时间等外界条件的影响。此外，饲养密度、光照等因素也对肌苷酸含量也有不同程度影响。目前，作为肉质评定的重要指标，肌肉组织中肌苷酸含量的测定已广泛应用于各种动物类肉制品的品质评定，已经成为衡量肉质品质的一项重要指标。因此，建立一种准确、快速、高效测定畜禽肌肉中肌苷酸含量的检测方法，对畜禽产品的品质评定具有重要意义。

3、作为畜禽肉中重要的鲜味物质之一，国内外关于畜禽产品中肌苷酸含量的测定有文献报道。目前，用于imp含量检测的方法，主要有薄层层析法、高压电泳+紫外分光光度法和高效液相色谱法等。紫外分光光度法测定肉制品中imp含量时，由于组成成分比较复杂，其测定过程容易受到其它物质的干扰，测定不准确；高效液相色谱法(high performanceliquid chromatography，hplc)具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高等优势，已被广泛应用于食品分析、生物、药物检测、化学化工等方面。

4、目前，关于畜禽肉中核苷酸含量测定国内外标准主要有jecfa标准ins no.630《5'-inosinic acid》、gb 1886.97—2015《食品安全国家标准食品添加剂5‘-肌苷酸二钠》附录a和qb/t 4261—2011《食品添加剂5′-肌苷酸二钠》，这3份标准均采用紫外分光光度法。近两年，山东省市场监督管理局颁布地方标准db 37/t 3816—2019《畜禽肌肉中肌苷酸含量测定高效液相色谱法》和宁夏化学分析测试协会颁布t/naia 003—2020《肌肉中肌苷酸的测定高效液相色谱法》，同时，国标gb 5413.40—2016《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》提供了针对婴幼儿食品和乳品种5种核苷酸的测定，未对畜禽肉产品制定相关标准。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种同时检测畜禽产品中九种呈味核苷酸的试剂盒及其方法，所述的这种同时检测畜禽产品中九种呈味核苷酸的试剂盒及其方法要解决现有技术中检测畜禽产品中胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)含量的方法复杂的技术问题。

2、本发明提供了一种同时检测畜禽产品中九种呈味核苷酸的试剂盒，所述的呈味核苷酸为胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)，包括：高浓度提取试剂、标准曲线溶液、高浓度磷酸盐缓冲溶液、ph调节溶液a、ph调节溶液b；

3、所述高浓度提取试剂为高氯酸；所述标准曲线溶液为九种呈味核苷酸的混合溶液；所述高浓度磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液；所述ph调节液a为氢氧化钠，所述的氢氧化钠的浓度为0.8mol/l～1mol/l；所述ph调节液b为磷酸，所述的磷酸的浓度为4mol/l～5mol/l。

4、进一步的，所述高浓度提取试剂中高氯酸的浓度为5％～6％(v/v)；所述高浓度磷酸盐缓冲溶液中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的浓度分别为8mol/l。

5、进一步的所述的九种呈味核苷酸混合溶液分别制作八个批次，第一次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为0.2μg/ml，第二次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为0.5μg/ml，第三次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为1.0μg/ml，第四次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为5.0μg/ml，第五次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为10.0μg/ml，第六次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为20.0μg/ml，第七次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为50.0μg/ml和第八次批次中的任意一种呈味核苷酸的浓度为100.0μg/ml。

6、本发明的一种同时检测畜禽产品中九种呈味核苷酸含量的方法，用于同时检测胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)的含量，包括如下步骤：

7、(1)在畜禽产品中加入高浓度提取试剂，用均质仪混匀，得到第一提取液；用高浓度提取试剂清洗均质仪刀头得到第二提取液；混合第一提取液和第二提取液，离心后取上清液过膜，得到样品溶液，然后进行高效液相色谱(配备紫外检测器)检测；

8、(2)准确吸取5ml高浓度磷酸缓冲溶液，加入900ml超纯水，用ph调节液a和ph调节液b调节ph至4.6，定容至1000ml，配制成0.04mol/l的磷酸盐缓冲液作为流动相；

9、(3)根据胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)混合标准工作溶液进行高效液相色谱检测，并以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，将样品溶液中胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)的色谱峰面积代入到标准工作曲线中，计算得到各物质的含量。

10、上述制备方法的优选方式如下：

11、所述步骤(1)中高浓度提取试剂为5％～6％(v/v)高氯酸溶液。

12、所述步骤(2)中高浓度磷酸盐缓冲溶液中磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的浓度分别为8mol/l。

13、所述步骤(1)、(3)中高效液相色谱(配备紫外检测器)参数均为：

14、色谱柱：c18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)或相当者；进样体积：5μl～10μl；柱温：30℃；

15、

16、流动相：准确吸取5ml浓度分别为8mol/l的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾混合溶液，加入900ml超纯水，用ph调节液a和ph调节液b调节ph至4.6，定容至1000ml，配制成0.04mol/l的磷酸盐缓冲液作为流动相；

17、检测波长：254nm；流速：0.8ml/min；

18、所述步骤(3)中混合标准工作溶液具体为：将胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)标准溶液用水配成0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、50.0μg/ml和100.0μg/ml的混合标准工作溶液。

19、进一步的，所述步骤(1)中畜禽产品和高浓度提取试剂的质量体积比为5g：10ml。

20、进一步的，所述步骤(1)中离心速率为8000r/min，离心时间为5min。

21、本发明的试剂盒可同时检测胞苷酸(cmp)、尿苷酸(ump)、鸟苷酸(gmp)、肌苷酸(imp)、腺苷酸(amp)、次黄嘌呤(hx)、肌苷(hxr)、二磷酸腺苷(adp)和三磷酸腺苷(atp)的含量。

22、所述胞苷酸(cmp)的标准工作曲线：y＝11.516x-0.9346，r2＝1；

23、所述尿苷酸(ump)的标准工作曲线：y＝14.196x+12.237，r2＝0.9999；

24、所述鸟苷酸(gmp)的标准工作曲线：y＝18.565x+0.1313，r2＝1；

25、所述肌苷酸(imp)的标准工作曲线：y＝12.403x+0.2704，r2＝1；

26、所述腺苷酸(amp)的标准工作曲线：y＝24.041x+1.2446，r2＝1；

27、所述次黄嘌呤(hx)的标准工作曲线：y＝41.09x-0.5925，r2＝1；

28、所述肌苷(hxr)的标准工作曲线：y＝24.191x-2.6361，r2＝1；

29、所述二磷酸腺苷(adp)的标准工作曲线：y＝14.106x+2.0176，r2＝1；

30、所述三磷酸腺苷(atp)的标准工作曲线：y＝17.514x+2.4349，r2＝1。

31、本发明采用高氯酸溶液、调节ph提取净化畜禽样品中的呈味核苷酸，通过液相方法实现了同时测定畜禽样品种中九种呈味核苷酸的含量，样品加标回收率在80.0％～97.6％，变异系数小于9.3％。本发明采用高氯酸提取液对产品中核苷酸进行提取，高效液相色谱检测九种呈味核苷酸化合物，通过出峰时间对其进行定性确证，具有较高的特异性，极大程度地降低了假阳性的发生概率。

32、本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明打破了传统紫外分光光度法单个检验法，针对畜禽产品能同时处理九种呈味核苷酸，仪器简便，大大提高了批处理量。本发明的方法操作简单、快速、准确度和灵敏度高，且能够做到批量测定，具有良好的实际应用前景。本发明填补了畜禽产品领域呈味核苷酸类检测方法的空缺，具有良好的应用前景。