一种肠炎宁制剂的检测方法与流程

本发明涉及中药领域，特别涉及一种肠炎宁制剂的检测方法。

背景技术：

1、收载于2020年版《中华人民共和国药典》的肠炎宁糖浆和肠炎宁片具有清热利湿、行气的功效，用于急、慢性胃肠炎，腹泻，细菌性痢疾，小儿消化不良等，临床应用广泛、疗效确切。除肠炎宁糖浆和肠炎宁片外，已取得国家药品批准文号的肠炎宁制剂还包括肠炎宁颗粒、肠炎宁胶囊、肠炎宁咀嚼片等剂型。目前肠炎宁糖浆药典标准中金毛耳草鉴别采用东莨菪内酯作为对照，但根据已有研究报道发现，斑地锦中也含有东莨菪内酯，可能存在干扰，申请人为了提高肠炎宁糖浆中金毛耳草鉴别的专属性，根据已有文献报道，前期开展了采用鸡屎藤苷甲酯作为对照的鉴别研究，但方法不可行。因此，为了更好地控制肠炎宁制剂的质量，申请人对肠炎宁制剂中金毛耳草新的鉴别方法进行了开发。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肠炎宁制剂的检测方法，本发明提供的检测方法有助于更好地控制肠炎宁制剂的质量。

2、本发明提供的检测方法包括采用鸡矢藤次苷甲酯对照品和/或金毛耳草对照药材作为对照的薄层色谱鉴别方法，和/或采用高效液相色谱法测定鸡矢藤次苷甲酯含量的方法。

3、本发明肠炎宁制剂中金毛耳草薄层色谱鉴别，供试品溶液制备方法为：取肠炎宁制剂或肠炎宁制剂水提取溶液，经大孔吸附树脂吸附后，依次用水和20％～40％醇溶液洗脱，弃去水洗脱液，收集20％～40％醇溶液洗脱液，蒸干，残渣加试剂溶解，即得。

4、本发明肠炎宁制剂中金毛耳草薄层色谱鉴别优选三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5:4:3:0.5)作为展开剂，显色剂为10％硫酸乙醇溶液。

5、本发明采用高效液相色谱法测定肠炎宁制剂中鸡矢藤次苷甲酯的含量，色谱条件可以采用：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—0.5％乙酸溶液为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～15min，甲醇体积百分比为5％→10％；15～20min，甲醇体积百分比为10％；20～50min，甲醇体积百分比为10％→30％；50～80min，甲醇体积百分比为30％→50％；柱温为20～40℃；检测波长为220nm～260nm。

6、本发明采用高效液相色谱法测定肠炎宁制剂中鸡矢藤次苷甲酯的含量，色谱条件可以采用：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0～11min，乙腈体积百分比为15％；11～19min，乙腈体积百分比为15％→21％；19～32min，乙腈体积百分比为21％→35％；柱温为20～40℃；检测波长为220nm～260nm。

7、本发明提供的检测方法可用于肠炎宁口服液、肠炎宁糖浆、肠炎宁胶囊、肠炎宁颗粒、肠炎宁片、肠炎宁咀嚼片、肠炎宁丸等肠炎宁制剂的鉴别和含量测定。

8、本发明创新之处在于：通过建立了专属性强的金毛耳草鉴别方法和鸡矢藤次苷甲酯含量测定方法，能够更好的控制肠炎宁制剂的质量。

9、下面将通过实验例对本发明作进一步说明。

10、实验例1肠炎宁糖浆中金毛耳草的鉴别研究

11、肠炎宁糖浆药典标准以东莨菪内酯对照品和金毛耳草对照药材为对照，采用通过hp-20型大孔吸附树脂用水和乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干后用甲醇溶解，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(5:3:1)为展开剂，在365nm下检视。柳润辉等(《植物资源与环境学报》,2001(01):60-61)从斑地锦中分离鉴定得到东莨菪内酯。研究过程中也发现，阴性样品(缺金毛耳草)在与东莨菪内酯对照色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，存在干扰。应萍等(《中华中医药学刊》,2009,27(12):2522-2524)对黄毛耳草进行了鸡屎藤苷甲酯tlc鉴别，艾样开等(《药物分析杂志》,2010,30(9):1760-1762)采用hplc法测定肠炎宁糖浆中鸡屎藤苷甲酯的含量，参考上述文献开展研究，未能建立肠炎宁糖浆中鸡屎藤苷甲酯的薄层鉴别方法。故对金毛耳草的鉴别方法进行重新研究。

12、1仪器与材料

13、仪器：goodsee-20e薄层色谱成像系统。

14、材料：肠炎宁糖浆样品(批号：180805、180901、180902、190201、190401、190402、190403、191001、191002、191101、191102，由江西康恩贝天施康药业有限公司提供)；金毛耳草药材(批号：yz002-200814)、金毛耳草对照药材(批号：121585-201302)，均由中国食品药品检定研究院提供；鸡矢藤次苷甲酯对照品(批号：100042-201810)，上海鸿永生物科技有限公司；硅胶g薄层板(批号：20200923青岛鼎康硅胶有限公司)；硅胶g薄层板(批号：20200701，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)；硅胶g薄层板(批号：20200902，青岛海洋化工有限公司)；聚酰胺-6-薄层板(批号20160203国药集团化学试剂有限公司)；聚酰胺-6-薄层板(批号20200928浙江台州市路桥四甲生化塑料厂)；试剂均为分析纯。

15、2液质研究

16、参考《中国药典》2020年版一部中肠炎宁糖浆【鉴别】项下(2)方法，制备获得肠炎宁糖浆供试品溶液、阴性样品溶液(缺金毛耳草)、金毛耳草对照药材溶液及空白溶剂溶液。

17、色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：agilent zorbax xdb-c184.6×250mm 5-micron)；以甲醇为流动相a，以0.5％乙酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm和360nm；柱温为30℃，进样量为10μl。

18、

19、质谱条件：离子源：esi(正、负离子)；毛细管电压(vcap):3500v；雾化器压力(nebulizer):35psig；毛细管出口电压(fragmentor)：65v；锥孔电压(skimmer)：65v；干燥气流速(drynggas):10l/min；碰撞能量：20v；扫描范围：100～1700m/z。

20、测定：精密吸取上述溶液各10μl，注入液质色谱仪，测定，即得。

21、结果：肠炎宁糖浆色谱图与阴性样品色谱图相比，其中多出一个碎片离子质荷比为463.1347的色谱峰，与前期肠炎宁制剂化学成分研究过程得到的鸡矢藤次苷甲酯碎片离子质荷比基本一致，经与鸡矢藤次苷甲酯对照品溶液色谱图比对，色谱峰保留时间相同，推断鸡矢藤次苷甲酯为金毛耳草的特征性成分，后续将围绕鸡矢藤次苷甲酯开展薄层鉴别方法开发。

22、3方法学研究

23、根据鸡矢藤次苷甲酯的化学性质并结合前期研究，建立能鉴别鸡矢藤次苷甲酯的薄层方法。

24、3.1分析方法建立

25、(1)制备方法及展开系统的考察

26、根据拟定的金毛耳草薄层方法并开展实验，具体方法如下：

27、制备方法①：取肠炎宁糖浆、阴性样品溶液(缺金毛耳草)和金毛耳草对照药材溶液(金毛耳草对照药材1g，加水50ml煎煮30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml)各1ml，分别加至d101大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，收集水洗脱液，再以25％乙醇60ml洗脱，收集25％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。

28、制备方法②：取肠炎宁糖浆、阴性样品溶液(缺金毛耳草)和金毛耳草对照药材溶液(金毛耳草对照药材1g，加水50ml煎煮30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml)各1ml，分别蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解,即得。

29、对照品溶液的制备：取鸡矢藤次苷甲酯对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

30、照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取供试品溶液、阴性样品溶液、对照药材溶液、鸡矢藤次苷甲酯对照品溶液各15μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5:4:3:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇，105℃烘5分钟，日光下检视。结果：供试品溶液制备方法①基本可行，但特征斑点颜色较浅，需继续优化；制备方法②通过直接蒸干复溶的方法无法进行鉴别，故舍弃。以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5:4:3:0.5)为展开剂，薄层图上各斑点的分离度较好，暂选该展开剂开展研究。

31、(2)供试品用量及点样量的考察

32、取肠炎宁糖浆2ml或5ml、阴性样品溶液(缺金毛耳草)5ml，分别加至d101大孔吸附树脂柱，通过多种方法制备获得供试品溶液。方法①：以水400ml洗脱，弃去水洗脱液，再以20％乙醇60ml洗脱，收集20％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得；方法②：以水200ml洗脱，弃去水洗脱液，再以20％乙醇60ml洗脱，收集20％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得；方法③：以水200ml洗脱，弃去水洗脱液，再以40％乙醇60ml洗脱，收集40％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。

33、金毛耳草对照药材1g，加水50ml煎煮30min，滤液蒸干，残渣加水10ml溶解，加至d101大孔吸附树脂柱，按上述方法②和方法③分别制备获得对照药材溶液。

34、分别吸取上述溶液15μl和25μl点样、展开、检视。结果：2ml上样量的供试品溶液斑点浅于5ml上样量的供试品溶液斑点；25μl点样量下供试品溶液及阴性色谱有过载表现，15μl点样量下色谱斑点清晰，但5ml上样量的供试品色谱底色较深；20％乙醇洗脱的供试品溶液斑点比用40％乙醇洗脱的供试品溶液斑点深。选择供试品上样量为5ml，点样量调整为10μl。

35、(3)洗脱溶剂和大孔树脂用量的考察

36、取肠炎宁糖浆5ml，加至填料量不同的d101型大孔吸附树脂柱(①内径2.5cm，柱高约3cm，体积15ml；②内径2.5cm，柱高约4cm，体积20m)以水300ml洗脱，弃去水洗脱液，再分别以不同浓度乙醇(20％、25％和30％)120ml洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

37、分别吸取上述溶液10μl点样、展开、检视。结果表明，供试品溶液制备过程中乙醇溶液浓度和树脂用量对薄层结果无显著影响。

38、(4)点样方式

39、吸取肠炎宁糖浆供试品溶液、金毛耳草对照药材溶液各10μl，分别以带状和点状点样点于同一硅胶g薄层板上，展开，检视。结果：点状点样有过载表现，带状点样结果良好，点样方式优选带状点样。

40、3.2方法确定

41、取肠炎宁糖浆5ml，通过d101型大孔吸附树脂柱(内径2.5cm，柱高3cm)，用水300ml洗脱，弃去水洗液，再用25％乙醇120ml洗脱，收集25％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取金毛耳草对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液回收至干，残渣加水10ml使溶解，自“通过d101型大孔吸附树脂柱”起，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别以条带状点样方式点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5:4:3:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

42、3.3方法验证

43、(1)不同厂家薄层板

44、取同一份肠炎宁糖浆供试品溶液和对照药材溶液点样、展开、检视，比较不同薄层板上斑点分离情况。

45、结果：不同厂家(青岛海洋、青岛海浪、青岛鼎康)薄层板供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，本方法对不同薄层板耐用性良好。

46、(2)不同温湿度

47、取同一份肠炎宁糖浆供试品溶液，分别在温度为10℃、20℃，湿度为35％、50％及75％时点样、展开、检视，记录斑点分离情况。

48、结果：不同温度条件下供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，本方法温度在10℃～20℃，湿度在35％～75％时耐用性良好。