一种新型的EDURISp蛋白质组学样品前处理方法与流程

本发明属于蛋白质组学，尤其是涉及一种新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法。

背景技术：

1、高性能液相串联质谱(hplc-ms)被广泛应用于生物系统中全蛋白质的定性和定量分析。在蛋白质组学分析中，需要特定的蛋白酶将蛋白质裂解为适合分子量检测的肽段。目前，蛋白质组学中常见的样品制备方法涉及使用重组的胰蛋白来裂解蛋白质成肽段，而碳酸氢铵则是质谱制备中最常用的盐之一。50mm的水溶性碳酸氢铵溶液可以提供胰蛋白有效工作所需的理想ph值范围为7.5-8.5。

2、然而，电喷雾质谱法要求去除碳酸氢铵，以避免在随后的质谱分析中产生任何负面影响。小分子盐由于其在电喷雾系统中的强离子化效应而引起显著的离子抑制和分析物灵敏度降低。过量的盐还可能导致一系列离子附加峰的生成，影响了质谱图中峰的识别和分组。此外，它们还可能腐蚀和污染质谱的硬件系统导致损坏。因此，建议在蛋白质组学样品的预处理过程中包括脱盐步骤，以避免这些潜在问题并确保可靠的结果。

3、目前，常用的脱盐方法是使用反相c18脱盐树脂柱。脱盐过程分为三个阶段：结合、洗脱和溶解。在结合阶段，肽段与高水相流动相中的反相柱之间的疏水相互作用使肽段结合到柱上。然后通过反复洗脱去除盐缓冲液。最后，通过有机溶剂破坏肽段与c18之间的疏水相互作用来洗脱肽段。然而，这种脱盐柱方法存在局限性。由于不同肽段对c18的吸附能力不同，该方法可能导致样品损失。具有强亲水性的肽段，例如磷酸化肽段，在结合阶段可能无法很好地结合到c18树脂上，而具有强疏水性的肽段可能会紧密结合到树脂上，但在洗脱阶段难以洗脱，导致损失。在脱盐过程中样品的选择性偏好可能损害质谱结果的客观性。此外，在洗脱过程中使用的有机溶剂可能溶解塑料制品中的聚合物，导致肽段样品的聚合物污染和质谱峰的位移。此外，在质谱分析之前，溶解在洗脱试剂中的肽段不能直接用作质谱样品，需要进行真空离心去除有机溶剂，然后再用0.1％甲酸复溶。总之，常用的蛋白质组学分析中的脱盐柱制备方法与重复性差和低蛋白质种类检测有关，因此迫切需要寻求脱盐的替代方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提出一种新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，为常用的脱盐柱方法提供了替代方案。该方法涉及在酶切后进行一步温度控制真空干燥和碳酸氢铵去除，从而产生脱盐的肽段样品，可直接用质谱分析。在分析之前，样品只需溶解在0.1％甲酸中，消除了多个步骤的需要，降低了与脱盐柱方法相关的样品损失风险。这种创新的脱盐方法克服了传统脱盐柱方法的局限性，如重复性差和蛋白质种类检测低的问题。它代表了蛋白质组学分析的有望进展，提供了更高的准确性和灵敏度。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，该方法包括如下步骤：

4、(1)蛋白质酶切

5、将待分析的蛋白质样品进行特定酶的切割，将其转化为适合质谱分析的肽段；

6、(2)温度控制真空干燥：在蛋白质酶切后，通过温度控制真空干燥过程，去除了样品中的盐，尤其是碳酸氢铵；

7、(3)0.1％甲酸溶解：

8、为了进一步准备样品进行质谱分析，脱盐后的肽段溶解在质量浓度0.1％甲酸中。

9、进一步，所述步骤(2)中的条件为在35-45℃和0.1mpa的温度控制真空离心机中干燥30分钟。

10、进一步，所述蛋白质酶切的步骤为：

11、(1)将蛋白质样品用盐酸胍稀释，然后加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(tcep)和碘乙酰胺(iaa)，并进行强烈的涡流混合，反应在室温下防光条件下孵育30分钟；

12、(2)将样品转移到超滤管中，室温下离心捕获蛋白质；

13、(3)随后，通过连续洗滤法清除蛋白质样品中的去垢剂、tcep和iaa等前处理试剂，即在过滤的同时连续补加碳酸氢铵盐溶液，保持样品体积恒定；碳酸氢铵盐重复进行五次以达成100000倍的缓冲液置换；

14、(4)上述超滤管中蛋白质样品缓冲液置换为碳酸氢铵缓冲液后，添加重组胰蛋白酶进行酶解，混合物在37℃下孵育过夜；

15、(5)酶解后，将混合物离心，收集滤液。

16、进一步，盐酸胍的浓度为6m，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的浓度为500mm，碘乙酰胺的浓度为1m，碳酸氢铵盐的浓度为50mm。

17、进一步，超滤管滤膜的标称分子量限值(nmwl)为10kda。

18、进一步，步骤(2)离心速度为7500-13000g，离心20分钟。

19、进一步，步骤(5)离心速度为7500-13000g。

20、相对于现有技术，本发明所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法具有以下优势：

21、本发明所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法引入了酶切结合超滤和快速原位样品纯化(enzymatic digestion with ultrafiltration and rapid in-situsample purification，edurisp)这一创新的蛋白质组学预处理技术，它结合了酶切、超滤和一步温控真空干燥，在酶切后进行一步温度控制真空干燥和碳酸氢铵去除，从而产生脱盐的肽段样品，可直接用质谱分析。在分析之前，样品只需溶解在0.1％甲酸中，消除了多个步骤的需要，降低了与脱盐柱方法相关的样品损失风险；成功克服了传统蛋白质组学分析方法的多项限制，包括样品损失、选择性偏好、污染和多步骤处理的复杂性。该方法不仅提供了更高的分析准确性和灵敏度，还降低了分析过程的复杂性，使蛋白质组学研究变得更加可靠和高效。这一创新的技术方案代表了蛋白质组学分析领域的重大进步，为生物科学研究和医学诊断提供了有力的工具。

技术特征：

1.一种新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：所述步骤(2)中的条件为在35-45℃和0.1mpa的条件控制真空离心机中干燥。

3.根据权利要求1所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：所述蛋白质酶切的步骤为：

4.根据权利要求3所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：盐酸胍的浓度为6m，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的浓度为500mm，碘乙酰胺的浓度为1m，碳酸氢铵盐的浓度为50mm。

5.根据权利要求3所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：超滤管滤膜的标称分子量限值为10kda。

6.根据权利要求3所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：步骤(2)离心速度为7500-13000g，离心20分钟。

7.根据权利要求3所述的新型的edurisp蛋白质组学样品前处理方法，其特征在于：步骤(5)离心速度为7500-13000g。

技术总结
本发明提供了一种新型的EDURISp蛋白质组学样品前处理方法，引入了酶切结合超滤和快速原位样品纯化这一创新的蛋白质组学预处理技术，它结合了酶切、超滤和一步温控真空干燥，以实现高效的原位样品脱盐纯化过程。EDURISp方法在广泛的分子量和亲水性范围内表现出卓越的蛋白质回收率，超越了传统的C18脱盐方法。利用EDURISp进行蛋白质组学分析展现了最高的蛋白质鉴定产出率，特别在膜蛋白鉴定方面具有显著的优势。值得注意的是，与传统的FASP方法相比，EDURISp在最小化氧化和去酰胺修饰方面表现出卓越的性能。这一创新的EDURISp方法代表了蛋白质组学分析的重大进展，为质谱分析提供可靠和高效的结果。

技术研发人员：路平
受保护的技术使用者：天津市眼科医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17