一种高效分离并检测异甘草酸镁及其有关物质的HPLC法及其应用的制作方法

本发明涉及药物分析，具体涉及一种高效分离并检测异甘草酸镁及其有关物质的hplc法及其应用。

背景技术：

1、异甘草酸镁是一种肝细胞保护剂，具有抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。目前异甘草酸镁在临床上用于治疗慢性病毒性肝炎和急性药物性肝损伤。其化学名称为(18α,20β)-20-羧基-11-氧代-30-去甲齐墩果-12-烯-3β-基-2-o-β-d-吡喃葡萄糖醛酸基-α-d-吡喃葡萄糖苷醛酸镁四水合物，化学结构如下：

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3、有关物质的存在直接关系到药品的质量和安全性。有关物质包括药物原料带入的杂质、过程中产生的有关物质以及降解相关的有关物质等，其会直接影响药物的纯度和质量，甚至会造成严重的不良反应，影响临床用药的有效性、安全性。为了提升异甘草酸镁的产品质量并保障临床用药安全有效，需充分研究其有关物质情况并开发适用的分离检测方法，将杂质控制在安全限度范围以内，实现药品质量可控，保障临床用药的安全有效。

技术实现思路

1、本发明一方面的目的在于提供一种高效分离并检测异甘草酸镁原料药或制剂中异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法，其中，色谱柱固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱柱温为20℃-40℃，流动相由a相和b相组成，所述a相为浓度为0.01m-0.1m的磷酸氢二钾溶液，b相为乙腈，流动相为梯度洗脱，流动相流速为0.8ml/min-1.2ml/min，进样体积为10μl-30μl，所述高效液相色谱法配紫外检测器，所述紫外检测器的检测波长为240nm-260nm，所述有关物质选自有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10、有关物质11、有关物质12和有关物质13中的任一种或其组合：

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5、本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为商购获得，优选为thermofisher、ymc、phenomenex、es、merck、agilent、kromasil、agela、techmate、waters或中谱红的任一公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱。

6、本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱选自eclipse plusc18、kromasil 100-5-c18、kromasil eternity-5-c18、kromasil eternityxt-10-c18、kromasil100-10-c18、kromasil 300-5-c18、ymc pack ods-aq c18、ymc pack ods-amc18、ymc triart c18、phenomenex kinetex c18、titank c18、es-c18、epic c18、zorbaxsb-c18、zorbax 300sb-c18、poroshell 120ec-c18、xdb-c18、tc-c18、extend-c18、bonshell c18、bonshell asb c18、venusil hlp c18、venusil c18 plus、venusil xbpc18(a)、venusil xbp c18(b)、venusil mp c18、innoval neo xd c18、techmate c18-st、techmate c18-stⅱ、techmate ci8 ug、中谱红aq-c18、waters xbridge c18、agilentzobax eclipse c18、waters xterra rp18、welch ultimate xb c18中的任一种或其组合。

7、本发明优选的技术方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱优选为watersxterra rp18 4.6×250mm，5μm。

8、本发明优选的技术方案中，所述色谱柱的柱温为25℃-35℃，优选为28℃-32℃，更优选为30℃。

9、本发明优选的技术方案中，所述流动相a磷酸氢二钾溶液的浓度为0.03m-0.08m，更优选为0.048m-0.052m。

10、本发明优选的技术方案中，所述流动相a磷酸氢二钾溶液的ph为6.0-8.0，优选ph为6.5-7.5，更优选ph为6.8-7.2，再优选ph为7.0。

11、本发明优选的技术方案中，所述流动相a磷酸氢二钾溶液用ph调节剂调节ph，所述ph调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸的任一种或其组合，优选为磷酸。

12、本发明优选的技术方案中，所述流动相a为0.05m磷酸氢二钾溶液，并且用磷酸调节ph为7.0。

13、本发明优选的技术方案中，所述流动相的梯度洗脱程序如下：

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15、本发明优选的技术方案中，所述流动相的梯度洗脱程序如下：

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17、本发明优选的技术方案中，所述流动相的梯度洗脱程序如下：

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20、本发明优选的技术方案中，所述流动相的梯度洗脱程序如下：

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22、本发明优选的技术方案中，所述流动相的梯度洗脱程序如下：

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24、本发明优选的技术方案中，所述流动相的流速为0.9ml/min-1.1ml/min，优选为1.0ml/min。本发明优选的技术方案中，所述进样体积为15μl-25μl，优选为18μl-22μl。

25、本发明优选的技术方案中，所述紫外检测器检测波长为245nm-255nm，优选为250nm。

26、本发明的优选技术方案中，出峰顺序依次为有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、异甘草酸镁、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10、有关物质11、有关物质12和有关物质13，其中，异甘草酸镁峰与有关物质5峰、有关物质6峰之间以及各有关物质峰之间的分离度均大于1.5。

27、本发明的优选技术方案中，所述高效液相色谱法包括下述步骤：

28、1)溶液配制：

29、溶剂：0.05m磷酸氢二钾溶液(用磷酸调ph值至7.0)-乙腈(90:10)，

30、供试品溶液：取异甘草酸镁适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg的溶液，

31、混合溶液：分别取异甘草酸镁、有关物质1、有关物质2、有关物质3、有关物质4、有关物质5、有关物质6、有关物质7、有关物质8、有关物质9、有关物质10、有关物质11、有关物质12和有关物质13各适量，先加乙腈溶解，再用溶剂稀释制成每1ml中约含异甘草酸镁1mg与分别含有关物质1～有关物质13各约1μg-10μg的混合溶液。

32、2)以色谱柱waters xterra rp18 4.6×250mm，5μm为固定相，柱温为25℃-35℃，流动相a为0.05m磷酸氢二钾溶液，流动相b为乙腈，所述a相磷酸氢二钾溶液用磷酸调ph值至6.8-7.2，将洗脱样品注入液相色谱仪，进样量为20μl，紫外检测器检测波长为250nm，流速为每分钟0.9ml-1.1ml，记录色谱图，所述梯度洗脱程序如下：

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34、本发明的另一目的在于提供本发明所述的分离检测异甘草酸镁及其有关物质的高效液相色谱法在用于高效分离并检测异甘草酸镁原料药或制剂中异甘草酸镁及其有关物质中的应用。

35、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

36、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

37、(1)本发明科学筛选优化了高效液相色谱法的洗脱条件，实现了对异甘草酸镁及其有关物质等14种结构近似、难以分离的化合物的有效分离与检测，分离效果良好，可以有效进行药品质量控制，减少药物临床试验中和治疗中可能出现的不良反应，保证了患者用药的有效性、安全性。

38、(2)本发明方法耗时短，可节约时间成本，提高经济效益，适宜工业化、规模化生产。本发明的流动相容易配制，按照常规方法配制即可。

39、(3)本发明方法专属性强，各有关物质与空白溶剂不互相干扰，各成分峰之间的分离度均大于1.5；本发明色谱条件检测有关物质灵敏度高；色谱条件微小变化时，不影响各成分峰分离，该方法的耐用性良好。