小鼠全长肠道冰冻瑞士卷的制作方法及小鼠肠道纵切台

本发明涉及小鼠肠道组织处理，具体为小鼠全长肠道冰冻瑞士卷的制作方法及小鼠肠道纵切台。

背景技术：

1、如何恰当处理小鼠肠道组织，包括快速解剖分离、及时固定等，对于后续组织切片的染色至关重要。目前常用的制备小鼠肠道组织切片的方法包括肠卷和肠段。肠卷制作的主要步骤为：将小鼠肠道沿长轴方向剪开，再将肠道沿剪开的方向卷起、缠绕成一卷，随后包埋成组织块。因其形态特征似瑞士卷，故该项技术又称为“swiss roll”。肠段反映的是全长肠道的部分随机区域，而瑞士卷则可以在一张切片上体现全长肠道的所有特征，允许我们对肠道进行详细而广泛的检查。该特点在肿瘤学的研究中具有重要意义。自从1937年magnus提出瑞士卷的概念(他使用的是临床胃组织标本)，而后reilly和kirsner在1965年首次将其应用于肠道，但细节不足。1981年moolenbeek对小鼠肠卷的制作进行了第一次较为详细的总结，而在1987年park将这一技术继续拓展至大鼠的胃肠道、食管、生殖系统，以及新西兰大白兔的大血管和气管。近十年来断续有文章发表改良的瑞士卷技术，来制备更好的小鼠肠道组织以供免疫组织化学或免疫组织荧光染色。

2、制备小鼠肠卷的一个关键步骤是将肠道组织纵向切开。目前在所有关于这一步骤的相关文献中，实验人员均选择使用解剖剪剪开小鼠全长肠道。这一操作要求实验人员具备一定的解剖经验和技术，否则纵向剪开的肠道组织边缘多不齐整，甚至会有缺失，为后续的操作增加难度；

3、目前制备小鼠肠卷多使用石蜡包埋。我们将肠道组织分段后(例如小肠分三段，而大肠为一段)，每段肠道组织各自制备成一块肠卷。因此一只小鼠的全长肠道将制备出四块肠卷，这无疑增加了样品保存的空间负荷。

技术实现思路

1、针对上述技术不足，本发明的目的是提供小鼠全长肠道冰冻瑞士卷的制作方法及小鼠肠道纵切台；该方法使用纵切台代替解剖剪来纵向切开肠道组织；将一只小鼠的肠道组织分段后(小肠分三段，而大肠为一段)，制备为一个肠卷冰冻组织块。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供小鼠全长肠道冰冻瑞士卷的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

4、步骤一：小鼠肠道的取材与固定；

5、(1)采用颈椎脱臼法牺牲小鼠，剃除小鼠腹部毛发，于腹正中线处剪一个小的v形切口，继续向上至胸骨、向下至耻骨剪开皮肤，延伸手术切口；

6、(2)充分暴露腹腔后，寻找胃与食管的交界处，于稍上方将其剪断；

7、(3)以断端为起始点，将胃肠道从腹腔中游离出来，同时剥离相关肠系膜及结缔组织；在游离过程中，注意适时用冷pbs冲淋游离出腹腔的胃肠道，使其保持湿润状态；

8、(4)将一条完整的胃肠道游离出腹腔后，立即将其浸泡在冷pbs中；

9、(5)用解剖剪将小肠按长度均分为三段，从胃侧向盲肠侧，依次标记为sb1、sb2、sb3；剪去盲肠后，留下的大肠标记为lb；

10、(6)使用装满冷pbs的简易冲洗管冲洗肠道内容物；使用的简易冲洗管的管身为10ml注射器，而管头则是将头皮针的针头剪去后制作而成的；

11、(7)肠道内容物冲洗完成后，使用小鼠肠道纵切台进行肠道的纵切；首先将裁剪好的吸水纸a用冷pbs浸湿后，放置在底座的台面上；然后将四根不锈钢棒依次穿过sb1、sb2、sb3和lb的肠腔，随后固定在台面上并放置好盖子；

12、(8)一手持镊子夹稳肠管最前端，另一手持无菌手术刀，以盖子中间的侧壁为支点，将肠道沿纵轴平整划开；此时若肠道仍部分贴合在不锈钢棒上，可使用装满冷pbs的10ml注射器沿手术刀切开方向喷洒液体，使肠道平铺在吸水纸a上；

13、(10)取下不锈钢棒后，用冷pbs湿润另一张吸水纸b，将其覆盖在切开的肠道组织上；将两张对合完全的吸水纸沿其长轴方向卷起成一空心管状，放入装满4％pfa的50ml离心管中，室温下固定24小时；

14、(11)固定24小时后，将pfa替换为15％蔗糖溶液，进行脱水24小时；

15、(12)15％蔗糖脱水24小时后，将其替换为30％蔗糖溶液，继续脱水24小时；

16、步骤二：制作小鼠全长肠卷的冰冻组织块；

17、(1)30％蔗糖脱水24小时后，将吸水纸从50ml离心管中取出，以吸水纸b朝上的方向在台面上展平；

18、(2)小心掀开吸水纸b，一手持弯镊夹住肠道的最前端，另一手持另一把镊子或徒手，轻轻夹住肠道的最远端，以肠粘膜面朝内为方向，将肠道卷起，成一管状；随后用30g针头以肠道最外侧端的稍内侧为入点，扎穿过整个肠卷，以防止其散开；小心松开弯镊，使其从固定好的肠卷中抽离出来；

19、(3)小心拔出30g针头，将四个肠卷按顺序直立放置在组织包埋盒中；

20、(4)用oct完整包裹住四块肠卷，然后将其放置在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋；在oct变白变硬后即可进行切片，也可保存于-80℃冰箱中备用。

21、本发明还涉及小鼠肠道纵切台，其特征在于，包括底座和盖子，盖子盖在底座上；所述底座两端各设置有一个凸起的棍架，所述棍架上等距设置有若干个凹槽，且和底座台面上的凹槽一一对应；所述盖子上设置有若干个贯穿槽，相邻两个贯穿槽之间的盖子部分形成刀切导向棱；所述刀切导向棱截面上部分为梯型结构，下部分为矩形结构。

22、本发明的有益效果在于：1、使用“小鼠肠道纵切台”纵向切开小鼠肠道组织，操作简单快速，肠道组织纵切效果佳，能有效缩短“肠组织离体到固定的时间”(小鼠肠道在取样后、固定前的短暂时间窗内会发生快速变化，间隔时间越长越不利于后续的组织染色分析)；

23、2、将一只小鼠的肠道组织制备到一个冰冻组织块中，能有效节省样本的储存空间；石蜡切片虽然可室温保存，但其染色步骤繁琐(冰冻切片无需脱蜡等前期步骤)，并且在免疫荧光染色的效果方面逊色于冰冻切片；在一张切片上染色以观察一只小鼠的全长肠道组织的概况，允许研究人员对整个肠道进行全面而仔细的观察，从而做出系统科学的组织学分析。

技术特征：

1.小鼠全长肠道冰冻瑞士卷的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.小鼠肠道纵切台，其特征在于，包括底座和盖子，盖子盖在底座上；所述底座两端各设置有一个凸起的棍架，所述棍架上等距设置有若干个凹槽，且和底座台面上的凹槽一一对应；所述盖子上设置有若干个贯穿槽，相邻两个贯穿槽之间的盖子部分形成刀切导向棱。

3.根据权利要求2所述的小鼠肠道纵切台，其特征在于，所述刀切导向棱截面上部分为梯型结构，下部分为矩形结构。

技术总结
本发明公开了小鼠全长肠道冰冻瑞士卷的制作方法及小鼠肠道纵切台，所述制作方法如下，步骤一：小鼠肠道的取材与固定；步骤二：制作小鼠全长肠卷的冰冻组织块。本发明使用小鼠肠道纵切台纵向切开小鼠肠道组织，操作简单快速，肠道组织纵切效果佳，能有效缩短肠组织离体到固定的时间；将一只小鼠的全长肠道组织制备到同一个冰冻组织块中，能有效节省样本的储存空间；石蜡切片虽然可室温保存，但其染色步骤繁琐，并且在免疫荧光染色的效果方面逊色于冰冻切片；在一张切片上染色并观察一只小鼠的全长肠道组织的概况，为研究人员对整个肠道进行全面而仔细的观察提供条件，有助于研究人员做出系统科学的组织学分析。

技术研发人员：李宁宁,姜友恒,李长学,林泽镕
受保护的技术使用者：中山大学附属第七医院（深圳）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11