专利名称：一种肠道病毒ev71型鼠适应株573及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肠道病毒EV71型鼠适应株，具体地说，是关于一种肠道病毒EV71 型鼠适应株573及其应用。
背景技术：
2008年3月，我国安徽省阜阳地区开始爆发手足口病疫情，导致23人死亡，3000 多人感染。之后，在北京、上海、浙江、广东等地区也相继有EV71感染的报道。2009年继河南省明泉县报道手足口病感染并有仅十例病人死亡后，相继在山东、北京、四川、广西、云南、甘肃、贵州等多个省市流行，患病人数和死亡人数超过2008年近两倍。2010年我国内地共有1，774，669个报告病例，造成905例死亡和超过2. 1万例重症。重症病例多由EV71感染引起，并且高达5%的重症死亡，致死原因主要为病毒感染引起过度的脑干脑炎。因此，控制重症是治疗手足口病、降低死亡率的关键。目前还没有能预防手足口病的疫苗，引起重症的致病机制仍不清楚，更没有控制重症的治疗手段。因此研究EV71感染神经系统中介导炎症反应的分子机制，揭示手足口病重症发生的机理，将为疫苗的设计以及治疗重症提供理论依据，并对保障我国儿童的生命安全和健康成长有重要意义。手足口病的主要病原体是属于微小病毒科(picornaviridae)中的肠病毒71型 (Enterovirus 71，EV71)和柯沙奇病毒 A16(Coxsackieviruses A16，CAV16)等，其中 EV71 是引起神经性症状和死亡的主要元凶。EV71于1969年从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中首次分离确定。自1974年首次报道以来，在1975，1978，1997和1998 年在分别在保加利亚，匈牙利，马来西亚和台湾等国家和地区引起了不同程度的爆发，涉及数十人死亡。研制EV71病毒疫苗及药物，有效控制手足口疫情，是目前摆在我国甚至全世界科研工作者面前的一个重大使命，但EV71研究中存在一个难题。任何一个疫苗和药物在上市之前都必须经过严格的实验，评估安全性和有效性。这其中就包括临床3期、临床2期、临床1期和进入临床实验前的动物实验。而EV71病毒具有种属限制，即病毒对人易感，对其它动物不敏感，使得临床前动物实验受到制约，无法对疫苗或其它药物的安全性和有效性进行准确的评估，阻碍了疫苗及药物的研发。尽管在台湾、日本等地的少数研究者已经获得了小鼠适应性病毒株，但因为知识产权等问题，这些病毒株无法用于我国的疫苗研制。中国专利文献CN :101864399A，公开了一株肠道病毒及其应用。中国专利文献CN 101906403A，公开了肠道病毒及其应用。中国专利文献CN 101717754A，公开了一株71型肠道病毒(简称EV71)及其应用。该文献报道的肠道病毒是通过蚀斑法分离的单克隆病毒， 该病毒株或由其生产的疫苗可用于预防由EV71病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是儿童的手足口病)。但是关于能有效感染实验小鼠产生适应性突变的病毒株目前还未见报道
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种肠道病毒EV71型鼠适应株 573。本发明的再一的目的是，提供一种肠道病毒EV71型鼠适应株573的用途。本发明的另一的目的是，提供一种以EV71型鼠适应株573为免疫原所制备的抗体。本发明的另一的目的是，提供一种抗体的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种肠道病毒EV71型鼠适应株573， 所述的EV71型鼠适应株573保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO V201110。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是 所述的EV71型鼠适应株573用于评估疫苗安全性和有效性。所述的EV71型鼠适应株573用于评估预防或者治疗EV71的生物和化学药物。所述的EV71型鼠适应株573用于评估EV71的诊断试剂。所述的EV71型鼠适应株573作为实验材料在EV71病毒学研究中的应用。所述的EV71型鼠适应株573作为实验材料在EV71病毒与免疫研究中的应用。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种通过EV71型鼠适应株 573为免疫原所制备的抗体。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是所述的抗体作为实验材料在 EV71病毒学免疫学研究中的应用。本发明建立的肠道病毒EV71型鼠适应株573通过以下方法
首先，本发明从阜阳地区手足口重症患者中分离到了 EV71病毒株，并命名为FY573。其次，本发明通过病毒培养感染和实验动物技术，获得了 ICR小鼠适应性毒株573 (Mouse-adapted virus strain 573,MAV573)。第三，为了进一步确认MAVS573基因特征，发明人对基因和氨基酸序列进行了比对，确定突变的氨基酸位点，工程化疫苗提供改造方案。第四，本发明建立了以ICR小鼠和MAV573为基础的动物感染模型。第五，本发明提供了基于MAV573或ICR小鼠和MAV573下的疫苗及各种抗病毒药物的研发及病毒免疫学基础研究的动物模型。本发明建立的肠道病毒EV71型鼠适应株573已保藏。保藏日期2011年4月 21日，保藏单位中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址武汉大学。保藏编号CCTCC V201110 。本发明优点在于
1、本发明通过EV71病毒临床株的分离、培养和动物感染筛选等技术手段，得到了能有效感染实验小鼠产生适应性突变的病毒株，为疫苗的研发、各种生化药物治疗的有效性评估、病毒感染机制和机体免疫反应等基础研究提供了有力的动物模型。2、本发明与原始毒株FY573比较表明该毒株不仅能在人源细胞株中培养，也能使鼠源细胞系发生病变，充分具备了鼠适应能力。
图1 人RD (人恶性胚胎横纹肌瘤细胞)和SK-N-SH(人神经母细胞瘤细胞)细胞系和鼠L929 (小鼠成纤维细胞)和NeUro-2a (小鼠脑神经瘤细胞)分别感染EV71FY573和 EV7Imav573 48小时后与没有感染(mock)相比，细胞病变情况的显微镜照片。显微镜放大倍数为100。图2 人 RD 和 SK-N-SH 细胞系和鼠 L929 和 Neuro_2a 分别感染 EV7 Ify573 和 EV7 Imav573 后，病毒复制和增长情况。图3 三日龄幼鼠感染EV71FY573、EV7Imav573病毒或细胞上清液对照(mock)后，小鼠存活情况。图4 感染EV71MV573的幼鼠大脑组织的EV71抗原组织化学图。图5 感染EV71MV573的野生型C57BL/6小鼠和IFNARl基因敲除小鼠的体重变化。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。本发明人经过深入研究，从临床样本中分离得到病毒株FY573，该病毒基因部分序列已经提交NCBI对外公布，基因号为HM064456. 1。该毒株能在体外感染人源细胞系，进行培养扩增，得到高滴度的病毒。起初，发明人用FY573病毒接种ICR品系一日龄小鼠、三至四日后从组织分离病毒、再次接种小鼠，并没有得到能再次感染小鼠的病毒。通过改进试验，将从组织分离得到的病毒经体外细胞培养后再感染小鼠，循环两轮，筛选得到了能使ICR小鼠致病的病毒株 MAVS573。进一步的细胞培养，与原始毒株FY573比较表明该毒株不仅能在人源细胞株中培养，也能使鼠源细胞系发生病变，充分具备了鼠适应能力。进一步，利用生物信息学手段， 发明人通过测序及序列比对，得到了鼠适应株与母本毒株(FY573)及NCBI数据库中两条 human EV71 (ACJ70062. 1，ACD63041. 1)序列比对，发现10个全新的突变位点(见表1)。表1鼠适应株氨基酸点突变
权利要求
1.一种肠道病毒EV71型鼠适应株573，其特征在于，所述的EV71型鼠适应株573保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :V201110。
2.根据权利要求1所述的EV71型鼠适应株573的应用，其特征在于用于评估疫苗安全性和有效性。
3.根据权利要求1所述的EV71型鼠适应株573的应用，其特征在于用于评估预防或者治疗EV71的生物和化学药物。
4.根据权利要求1所述的EV71型鼠适应株573的应用，其特征在于用于评估EV71的诊断试剂。
5.根据权利要求1所述的EV71型鼠适应株573的应用，其特征在于所述的EV71型鼠适应株573作为实验材料在EV71病毒学研究中的应用。
6.根据权利要求1所述的EV71型鼠适应株573的应用，其特征在于所述的EV71型鼠适应株573作为实验材料在EV71病毒与免疫研究中的应用。
7.一种通过权利要求1所述的EV71型鼠适应株573为免疫原所制备的抗体。
8.根据权利要求7所述的抗体的应用，其特征在于所述的抗体作为实验材料在EV71 病毒学免疫学研究中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种肠道病毒EV71型鼠适应株，所述的EV71型鼠适应株573保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOV201110。本发明还提供了通过EV71型鼠适应株573为免疫原所制备的抗体及其应用。本发明通过EV71病毒临床株的分离、培养和动物感染筛选等技术手段，得到了能有效感染实验小鼠产生适应性突变的病毒株，为疫苗的研发、各种生化药物治疗的有效性评估、病毒感染机制和机体免疫反应等基础研究提供了有力的动物模型。本发明与原始毒株FY573比较表明该毒株不仅能在人源细胞株中培养，也能使鼠源细胞系发生病变，充分具备了鼠适应能力。
文档编号C12N7/00GK102220288SQ20111011355
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者万俊峰, 冷启彬, 张娜, 方钟, 朱理业, 杨春富 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所