一种检测D-阿洛酮糖的方法及试剂盒

本发明属于快速检测，具体涉及一种检测d-阿洛酮糖的方法及试剂盒。

背景技术：

1、天然代糖如d-阿洛酮糖等由于来源于植物或者微生物，具有安全性高、稳定性好、口感好及热量低等众多优点，被认为是最理想的糖替代品之一。d-阿洛酮糖是d-果糖c-3位的差向异构体，天然的d-阿洛酮糖少量存在于小麦、无花果、葡萄干等食物中。美国食品与药品管理局（fda）已将d-阿洛酮糖确定为普遍公认安全食品，并可作为食品或食品添加剂的组成成分。同时，d-阿洛酮糖已成为海外品牌炙手可热的食品原料添加剂，全球已有包括日本、韩国、新加坡在内的多个国家将其授权为食品可用成分。

2、然而，d-阿洛酮糖作为一种稀有糖，天然含量极低，从天然产物中提取d-阿洛酮糖往往存在成本高、分离纯化困难的问题。因此，通过酶法和微生物发酵法来合成d-阿洛酮糖成为领域内研究的主要方向。d-果糖和d-阿洛酮糖为同分异构体，同时d-果糖也是d-阿洛酮糖的重要前体，d-果糖和d-阿洛酮糖水溶液的颜色均无色透明，如何从d-果糖和d-阿洛酮糖的混合物中鉴定出是否含有d-阿洛酮糖一直是困扰本领域技术人员的难题。现有技术主要通过高效液相色谱法对样品中的d-阿洛酮糖进行定性和定量分析，该方法虽然具有高精度的优势，但检测成本高，耗时长。因此，寻找一种高效、灵敏的检测d-阿洛酮糖的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种检测d-阿洛酮糖的方法及试剂盒。

2、本发明目的通过以下技术方案实现：

3、一种检测d-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：

4、（1）将若干个不同浓度的d-阿洛酮糖溶液与atp、鼠李酮糖激酶混合，反应，得到反应后的混合液；向反应后的混合液中加入过氧化氢、显色剂和含氢离子的小分子溶液，继续反应，得到已知浓度的反应产物；

5、（2）将含有待测样品的原液或稀释液与atp、鼠李酮糖激酶混合，反应，得到反应后的混合液；向反应后的混合液中加入过氧化氢、显色剂和含氢离子的小分子溶液，继续反应，得到待测样品反应产物；

6、（3）依据已知浓度的反应产物的颜色，判断待测样品反应产物中是否含有d-阿洛酮糖，判断标准如下：若待测样品反应产物的颜色与d-阿洛酮糖为0的已知浓度的反应产物的颜色相当时，表示待测样品中不含d-阿洛酮糖；若待测样品反应产物的颜色比d-阿洛酮糖为0的已知浓度的反应产物的颜色深时，表示待测样品中含有d-阿洛酮糖；

7、（4）将步骤（1）得到已知浓度的反应产物和待测样品反应产物在相同波长下检测；将已知浓度的反应产物的检测值制作标准曲线，依据标准曲线和待测样品反应产物的检测值，得到待测样品中d-阿洛酮糖的浓度。

8、步骤（1）所述的已知浓度的反应产物中d-阿洛酮糖的浓度优选为0～10mm；更优选为0、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm。

9、步骤（1）和（2）中，所述的d-阿洛酮糖溶液的溶剂优选为tris-hcl缓冲液；进一步优选为50～200 mm tris-hcl缓冲液，ph=7～9；更优选为100mm tris-hcl缓冲液，ph=8。

10、步骤（1）和（2）中，所述的反应的条件优选为30～40℃反应25～35min；更优选为35℃反应30min。

11、步骤（1）和（2）中，所述的继续反应的条件优选为35～45℃反应3～7min；更优选为40℃反应5min。

12、步骤（1）和（2）中，所述的显色剂优选为2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（abts）。

13、步骤（1）和（2）中，所述的含氢离子的小分子溶液优选为盐酸溶液。

14、步骤（4）中，所述的波长优选为420nm。

15、一种检测d-阿洛酮糖的试剂盒，所述试剂盒基于上述方法设计得到，包括以下成分：含氢离子的小分子检测液、过氧化氢、显色剂、鼠李酮糖激酶、atp和d-阿洛酮糖标准溶液。

16、所述的d-阿洛酮糖标准溶液为已知浓度的d-阿洛酮糖溶液。

17、本发明的制备方法具有如下优点及有益效果：

18、（1）易于操作，检测快速，相比于现有定量检测方法，本发明的检测方法可在60min内对批量样品进行检测，并能定量反映出样品中d-阿洛酮糖的浓度或含量。

19、（2）该反应具有显色效应，可以通过直观观测做出定性判断，并且不受d-果糖干扰，在测定范围内线性良好。

20、（3）本发明在检测过程中无需使用大型精密仪器或设备，显著降低了检测成本。

21、（4）本发明所述方法不仅可以实现对酶法或生物发酵法合成的d-阿洛酮糖进行快速检测，而且可以对天然产物、食品、保健品中的d-阿洛酮糖进行检测，还可以对高活性的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行高通量筛选。

技术特征：

1.一种检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤（1）所述的已知浓度的反应产物中d-阿洛酮糖的浓度为0～10mm。

3.根据权利要求2所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述的已知浓度的反应产物中d-阿洛酮糖的浓度为0、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm。

4.根据权利要求1所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，所述的反应的条件为30～40℃反应25～35min。

5.根据权利要求1所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，所述的继续反应的条件为35～45℃反应3～7min。

6.根据权利要求1所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，所述的d-阿洛酮糖溶液的溶剂为tris-hcl缓冲液。

7. 根据权利要求6所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：所述的tris-hcl缓冲液的浓度为50～200 mm，ph=7～9。

8.根据权利要求1所述的检测d-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中，所述的显色剂为2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐；所述的含氢离子的小分子溶液为盐酸溶液。

9.一种检测d-阿洛酮糖的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒基于权利要求1～8任一所述方法设计得到，包括以下成分：含氢离子的小分子检测液、过氧化氢、显色剂、鼠李酮糖激酶、atp和d-阿洛酮糖标准溶液。

技术总结
本发明属于快速检测技术领域，公开了一种检测D‑阿洛酮糖的方法及试剂盒。本发明所述方法通过已知浓度的反应产物和待测样品反应产物的颜色变化判断是否含有D‑阿洛酮糖，并通过标准曲线确定D‑阿洛酮糖的浓度。本发明所述方法不仅可以实现对酶法或生物发酵法合成的D‑阿洛酮糖进行快速检测，而且可以对天然产物、食品、保健品中的D‑阿洛酮糖进行检测，还可以对高活性的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶进行高通量筛选。

技术研发人员：李成伟,倪子富,孙忠科,聂阿真
受保护的技术使用者：河南工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17