一种在线二维半制备液相色谱分离纯化尿液中糖皮质激素的方法

本发明属于糖皮质激素纯化，尤其涉及一种在线二维半制备液相色谱分离纯化尿液中糖皮质激素的方法。

背景技术：

1、20世纪60年代开始，运动员开始使用糖皮质激素兴奋剂，可帮助维持运动状态增加运动负荷，缓解身体疼痛及运动疲劳，分解脂肪，增强氧化代谢水平，提高中枢神经系统兴奋性。短期摄入糖皮质激素可提高运动员在训练过程中的注意力、集中力、耐力。糖皮质激素(glucocorticoid，gc)被世界反兴奋剂机构(world anti-doping agency，wada)列入《禁用清单》的s9类禁用物质。wada规定禁止在赛内以口服、注射、直肠用药、涂抹等任何形式使用糖皮质激素。

2、蛋白同化雄性类固醇(anabolic alldrogenic steroids，aas)可促进肌肉生长与蛋白质合成，刺激红细胞生成，短期使用aas可增加肌肉重量，加速运动疲劳的恢复，改善运动表现。aas是经国际奥委会认可的被运动员滥用最多的兴奋剂，wada已将aas列入《禁用清单》的s1类禁用物质。

3、类固醇激素划分为肾上腺皮质激素和性激素两类。肾上腺皮质激素由肾上腺皮质分泌产生，又可划分为糖皮质激素和盐皮质激素，性激素包括雄性激素和雌性激素，被违规使用作为运动兴奋剂的是aas。

4、针对兴奋剂的检测开发了多种基质，兴奋剂常规检测中使用的基质为血清、血浆、尿液和唾液等，较常使用的是尿液基质，尿液样本可以提供较长的窗口期、易取得、无侵入性。

5、gc的药代动力学是复杂的，受给药途径和给药部位的影响。wada在2023年技术文件(td)中规定对糖皮质激素的母体化合物及其代谢产物的报告水平为30ng/ml，当尿中糖皮质激素浓度低于30ng/ml时可不启动同位素比质谱确证程序，当尿中糖皮质激素浓度处于30-60ng/ml，实验室会认定为不良分析结果(aaf)，需启动确证程序进行同位素比质谱检测以溯源来源，当尿样中的δ13c值与内源性参照化合物的δ13c值差值大于4‰时，该尿样被判定为阳性样本。

6、对文献进行检索调研时发现，目前针对尿样中的糖皮质激素进行分离的方法主要有两类，一类是对尿液样本进行酶解等前处理，进行两次离线的液相色谱分离；另一类是经过酶解、衍生化等前处理，进行两次离线的液相色谱分离。这两种分离方法会增加成本及工作量，造成更多目标组分损耗，更多的引入杂质，影响同位素比质谱测定结果。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出了一种在线二维半制备液相色谱分离纯化尿液中糖皮质激素的方法。为了进一步提升对糖皮质激素的分离纯化效果，本发明建立的二维液相色谱分离检测方法不需要进行衍生化，在前处理之后，一次完成分离泼尼松、泼尼松龙、孕烷二醇和孕烷三醇，减少工作量并且降低成本，高效率富集目标组分，有助于准确测定同位素比质谱结果。

2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

3、一种在线二维半制备液相色谱分离纯化尿液中糖皮质激素的方法，包括以下步骤：

4、(1)将待测尿液进行前处理，将前处理获得的提纯组分用上机液溶解，上样到第一维色谱系统；

5、(2)洗脱第一维色谱柱，检测器见峰切换阀；

6、(3)切换阀，流出组分上样到第二维色谱系统；

7、(4)洗脱第二维色谱柱，检测器确认收集窗口后收集。

8、进一步的，步骤(1)中，所述将待测尿液进行前处理指的是：取4ml尿样到玻璃管中，加入1ml pbs(ph＝6.63)，再加入β-葡萄糖醛酸甙酶(2500单位)100μl，55℃水浴1小时，取出放置至室温，加入800μl的碱性溶液，再加入4ml甲基叔丁基醚(mtbe)，振荡30分钟，取上清液进行氮吹，然后用80μl甲醇复溶转移，再次氮吹。

9、进一步的，步骤(1)中，所述第一维色谱系统中含有第一维色谱柱，所述第一维色谱柱为c18柱(25cm，4.6mm，5μm)。

10、进一步的，步骤(1)中，上样量为50μl。

11、进一步的，步骤(1)中，所述上机液为甲醇、乙醇、异丙醇和水中的至少一种，优选为甲醇和水；

12、所述第一维色谱系统中的流动相为甲醇、异丙醇、乙腈和水中的至少一种，优选为乙腈和水；

13、所述第一维色谱系统中流动相的流动速度为1ml/min；

14、所述第一维色谱系统中的柱温为20～35℃，优选为20℃、30℃或35℃，更优选为20℃；

15、所述第一维色谱系统所用的紫外吸收波长为192nm或254nm，优选为192nm。

16、进一步的，步骤(2)中，流动相洗脱时间为36～50min，优选为36min、38min、43min或50min，更优选为50min。

17、进一步的，步骤(3)中，所述第二维色谱系统中含有第二维色谱柱，所述第二维色谱柱为excel 5c18amide色谱柱(25cm，4.6mm，5μm)；

18、所述切换阀为六通阀、八通阀或十通阀，优选为六通阀。

19、进一步的，步骤(3)中，所述第二维色谱系统所用的流动相为甲醇、异丙醇、乙腈和水中的至少一种，优选为甲醇和水；

20、所述第二维色谱系统中流动相的流动速度为1ml/min；

21、所述第二维色谱系统中的柱温为20～35℃。

22、进一步的，所述第二维色谱系统中的柱温为20℃、30℃或35℃，优选为20℃。

23、进一步的，步骤(3)中，所述第二维色谱系统所用的紫外吸收波长为192nm或254nm，优选为254nm。

24、进一步的，步骤(4)中，第二维色谱系统所用的流动相洗脱时间为45min或50min，优选为50min。

25、本发明提供的在线二维半制备液相色谱方法是针对糖皮质激素兴奋剂阳性尿液样本中进行分离纯化，泼尼松和泼尼松龙结构相似容易在色谱共流出，通过在线中心切割模式对目标化合物进行富集和分离，在通过第一维色谱系统时将泼尼松和泼尼松龙切换到第二维色谱柱进行进一步分离，最终在第二维色谱柱上得到分离度及峰型良好的泼尼松和泼尼松龙色谱峰。本发明建立的线二维半制备液相色谱法分离纯化方法具有分析速度快、减少人工操作、重复性良好等优点，在线二维液相色谱分离可以提供足够的分辨率和峰容量，一次完成分离可减少工作量并降低成本，高效富集目标组分，降低基质效应对目标物出峰的影响，有助于准确测定碳同位素比值结果。

26、在线二维液相色谱分离模式是进行连续两次色谱分离，自动化程度高，省时省力。离线模式中目标成分容易发生损耗，容易引入杂质，而在线二维液相色谱提高了分离效率、分析速度快，在第一维色谱系统中不能够完全分离的组分或者分离度较差的组分可在第二维系统中得到更好的分离，极大的提高了分离效率和分离能力。因此，本发明不仅在兴奋剂检测领域，在化学分析、药物分析、临床检测等领域都有潜在应用价值。

27、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

28、1)前处理简便，不需要进行衍生化节省时间，目前对糖皮质激素进行液相分离的方法均需要采用两次离线的液相色谱分离，方法耗时时间长，增加工作量并且繁复的前处理易造成目标化合物的损耗，本方法采用的二维半制备液相色谱系统可以克服以上不足，在线分离减少分离时间，降低工作量，帮助富集目标化合物；

29、2)减少对溶剂消耗，节约成本，传统的两次离线液相色谱分离，中间萃取溶剂消耗量大，本方法采用的二维半制备液相色谱系统可以克服以上不足，本发明方法不需要进行反复萃取，尿样经过前处理直接上样色谱系统，经第一维中切换窗口将目标成分切入第二维分离系统进行进一步分离纯化，一次进样就可以在第一维收集器和第二维收集器中得到孕烷二醇、孕烷三醇、泼尼松、泼尼松龙四个目标化合物；

30、3)由于使用的是在线二维色谱分离系统，本发明选择采用在线二维液相色谱分离方法，在线二维液相色谱分离相较于一维色谱分离而言，可提供足够的分辨率和峰容量。一次完成分离，减少工作量并降低成本，高效富集目标组分，降低基质效应对目标物出峰的影响，有助于准确测定同位素比质谱结果。二维液相色谱使用的工作台是：openlabchemstation色谱数据系统，搭载lts 01.11软件。同一个界面可同时查看进样器、收集器、dad等所有仪器的状态。

31、4)本发明使用的二维模式是中心切割模式，将第一维馏分中感兴趣的部分(泼尼松、泼尼松龙以及地塞米松)(地塞米松为第二维色谱系统中内标)直接切入第二维进行分离，与离线模式相比，在线模式具有分析速度快、自动化程度高、重复性好等优点。快速更换切换阀直接操作控制色谱柱之间切换，无需断开并重新连接色谱柱，提供了更高的灵活性。