一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法与流程

本发明属于免疫分析，具体涉及一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法。

背景技术：

1、吖啶酯化学发光体系发光体系简单，不需要催化剂，在有h2o2的稀碱性溶液中即能发光，无需增强剂，背景低，灵敏度高且干扰较小，光释放快速、集中。吖啶酯与蛋白质能通过化学键紧密连接，稳定性好，且吖啶酯分子量小，对联结后的抗体构象影响小。吖啶酯与大分子抗原/抗体连接后，可通过透析、脱盐等方法进行纯化，减少非特异性吸附，但吖啶酯与小分子偶联，如孕酮衍生物，还存在纯化困难的问题。

2、现市面上，若直接得到吖啶酯-孕酮的高纯度合成物，需定做，价格贵；采用交联剂偶联，标记过程中常常吖啶酯过量，游离吖啶酯可能导致非特异性吸附，导致信噪比低，虽然现可用层析柱对小分子进行分离纯化，但分离工艺复杂、所耗时间长、所需溶剂量大，在实际生产中，很难工业化。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，该方法通过利用对孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化，再配以吖啶酯标记后的透析纯化，能够达到有效对游离吖啶酯进行纯化，减少非特异性吸附，有更高信噪比，且更简易生产，性价比高。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，包括如下步骤：

4、s1、孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化：

5、选取孕酮小分子衍生物并溶解后，加入活化剂活化处理，活化处理完成后加入牛血清白蛋白溶液，进行室温避光混匀反应，然后进行透析纯化处理，获得混合液i；

6、所述孕酮小分子衍生物与牛血清白蛋白的摩尔浓度比为1:1-2:1；

7、s2、吖啶酯标记和透析纯化：

8、在获得的混合液i中加入吖啶酯溶液，室温避光反应后进行透析纯化处理，获得混合液ii，完成标记。

9、上述吖啶酯为常用的吖啶酯，nsp-sa-nhs，

10、

11、上述牛血清白蛋白，为大分子蛋白，与小分子的吖啶酯偶联后，在透析过程中可以留在透析袋内，而没有偶联上牛血清白蛋白的吖啶酯，转移到透析袋外，可有效除去过量的吖啶酯小分子，起到减少非特异性吸附的作用。

12、透析原理：是通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。

13、作为优选地，所述s1中，选用质量浓度为20mg/ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解孕酮小分子衍生物。

14、上述n,n-二甲基甲酰胺是作为溶剂溶解孕酮小分子衍生物。

15、作为优选地，所述s1中，活化剂为二环己基碳二亚胺溶液与n-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液；

16、所述二环己基碳二亚胺溶液与n-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合体积比为1:1；

17、所述二环己基碳二亚胺溶液的质量浓度为40mg/ml，与n-羟基琥珀酰亚胺溶液的质量浓度为40mg/ml。

18、上述二环己基碳二亚胺是与羧基反应的交联剂；n-羟基琥珀酰亚胺是与二环己基碳二亚胺、羧基反应后产生的中间产物反应的交联剂，可使中间产物更稳定。

19、作为优选地，所述s1中，活化处理为在孕酮小分子衍生物溶液中加入活化剂混匀后，室温滚动混匀反应12-18h的处理过程。

20、作为优选地，所述s1中，牛血清白蛋白溶液是由牛血清白蛋白与ph 7.2-ph7.6的磷酸盐缓冲液涡旋混匀溶解得到；

21、所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为2.5mg/ml；

22、所述室温避光混匀反应时长为0.5-2h。

23、作为优选地，所述s1中，所述透析纯化处理为在2-8℃环境下，ph 7.2-ph7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次ph 7.2-ph 7.6的磷酸盐缓冲液。

24、作为优选地，所述s2中，吖啶酯溶液质量浓度为5mg/ml；

25、所述孕酮小分子衍生物与吖啶酯摩的摩尔浓度比为1:10-1:20。

26、作为优选地，所述s2中，室温避光反应1h；

27、所述s2中透析纯化处理为在2-8℃环境下，ph 7.2-ph 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次ph 7.2-ph 7.6的磷酸盐缓冲液。

28、上述透析纯化与不进行纯化的技术相比，透析纯化可以除去多余吖啶酯，减少非特异性吸附，有更高信噪比；与层析柱纯化工艺比，分离工艺更简单，成本更低，更易工业化。

29、作为优选地，还包括在获得混合液ii后，加入50％的甘油，混匀后，在-20℃避光保存。

30、上述加入甘油的目的是：避免产物在-20℃保存时反复冻融，影响反应性。

31、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

32、本发明提供了一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，该方法通过利用对孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化，再配以吖啶酯标记后的透析纯化，与现有的直接偶联不纯化的技术相比，能够达到有效对游离吖啶酯进行纯化，减少非特异性吸附，有更高信噪比，且更简易生产，性价比高。

技术特征：

1.一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s1中，选用质量浓度为20mg/ml的n,n-二甲基甲酰胺溶解孕酮小分子衍生物。

3.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s1中，活化剂为二环己基碳二亚胺溶液与n-羟基琥珀酰亚胺溶液的混合液；

4.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s1中，活化处理为在孕酮小分子衍生物溶液中加入活化剂混匀后，室温滚动混匀反应12-18h的处理过程。

5.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s1中，牛血清白蛋白溶液是由牛血清白蛋白与ph 7.2-ph7.6的磷酸盐缓冲液涡旋混匀溶解得到；

6.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s1中，所述透析纯化处理为在2-8℃环境下，ph 7.2-ph 7.6的磷酸盐缓冲液搅拌透析6-12h，其中3-6h时替换一次ph 7.2-ph 7.6的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s2中，吖啶酯溶液质量浓度为5mg/ml；

8.根据权利要求7所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，所述s2中，室温避光反应1h；

9.根据权利要求1所述的一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，其特征在于，还包括在获得混合液ii后，加入50％的甘油，混匀后，在-20℃避光保存。

技术总结
本发明公开了一种吖啶酯标记孕酮小分子衍生物的方法，属于免疫分析技术领域。该方法通过利用对孕酮小分子衍生物的活化和透析纯化，再配以吖啶酯标记后的透析纯化，与现有的直接偶联不纯化的技术相比，能够达到有效对游离吖啶酯进行纯化，减少非特异性吸附，有更高信噪比，且更简易生产，性价比高。

技术研发人员：许敏,柳乐,王健,周献军,黄敬双,鲜静,张伟,段继龙,刘欣,范雨鑫
受保护的技术使用者：四川希格瑞生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7