闽产三叶青饮片及其检测方法、以及产地鉴别方法与流程

本发明涉及闽产三叶青饮片及其检测方法、以及产地鉴别方法，属于中药材质量检测控制领域。

背景技术：

1、三叶青(tetrastigma hemsleyanum diels&gilg)为我国特有珍稀药材，福建特色畲药，其地上部分和块根均可入药，别名金钱吊葫芦[1]，其中块根药用价值最高，《福建省中药饮片炮制规范》、《浙江省中药饮片炮制规范》、《浙江省中药材标准》收载三叶青药用部位为块根。中医药理论认为三叶青微苦、辛，凉。归心、肝、肺、肾经，具清热解毒、消肿止痛，祛风除湿，化痰。用于小儿高热惊风，百日咳，疗疮痈痕，毒蛇咬伤。现代用于癌肿、淋巴结核。

2、三叶青药用历史悠久，经考证其收录于《植物名实图考》，中医认为其具有清热解毒、消肿止痛、祛风除湿等功效，作用独特。三叶青在民间作为儿童常用药主要治疗热惊厥、支气管炎、咽炎、病毒性脑膜炎等。三叶青因其具有独特疗效，常作为组方君药运用在多种复方[1]，如结石康胶囊、金丝地甲胶囊、金芪片等；在临床案例中，三叶青为原料的金芪片治疗恶性肿瘤的有效率达78.33％；三叶青能增强机体免疫力和抗氧化能力、保护肝脏免受化学损伤等特点。现代化学研究，迄今为止研究者采用不同溶剂和分离方法对三叶青的地上部分或块根进行系统研究，从中分离并鉴定近80个化合物，三叶青主要含有多糖、黄酮及其苷类、氨基酸、萜类以及脂肪酸和挥发油成分(刘俊秋,高语枫,郑佳怡,等.三叶青化学成分及其抗肿瘤作用研究进展[j].中国实验方剂学杂志,2022,28(09):233-241、李瑛琦,陆文超,于治国.三叶青的化学成分研究[j].中草药,2003(11):25-26.、郭晓江.两种药用植物的化学成分及生物活性研究[d].山东大学,2013.)。其中，黄酮类为三叶青主要化学成分类型，具有显著的生物活性；在抗肿瘤方面表现在抑制多种肿瘤细胞，包括肺癌、肝癌、乳腺癌等；化学成分含量比较研究发现(范世明,黄泽豪,林婧,等.蛇附子中4种黄酮类成分的分离及含量测定[j].中药材,2014,(12):2226-2230.、许文,傅志勤,林婧,等.uplc-ms/ms法同时测定三叶青中10种黄酮类成分[j].药学学报.2014,49(12):1711-1717.陈丽芸.三叶青化学成分及抗肿瘤活性研究[d]、林婧,纪明妹,黄泽豪,等.三叶青的化学成分及其体外抗肿瘤活性研究[j].中国药学杂志,2015,50(8):658-663.、liu d,ju jh,lin g,et al.newc-glycosyl flavones from tetrastigma hemsleyanum (vitaceae)[j].acta botanicasinica.2002,44(2):227-229.傅志勤,黄泽豪,林婧,等.蛇附子化学成分及抗氧化活性研究[j].中草药.2015,46(11):1583-1588.)不同产地的黄酮成分含量差异明显，即不同产地三叶青化学物质基础不同。

3、关于三叶青化学成分质量评价研究已有报道，卞智慧采用hplc法测定三叶青中绿原酸、异槲皮苷、山奈酚-3-o-芸香糖苷、槲皮素4种成分的含量；李飘等采用hplc同时测定不同产地三叶青中绿原酸、咖啡酸、荭草苷、芦丁、紫云英苷、槲皮素、白藜芦醇7种成分的含量；蓝艳等建立uplc同时测定不同产地三叶青不同部位中7种活性成分含量，分别为儿茶素、原花青素b1、芦丁、异槲皮素、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷、芹菜素；李春华等采用uplc-ms/ms同时测定三叶青中13种黄酮类成分(原花青素b1、原花青素b2、儿茶素、异槲皮苷、芦丁、山奈酚-3-o-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-o-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山奈酚和异鼠李素)的含量。林婧,纪明妹,黄泽豪,等.三叶青的化学成分及其体外抗肿瘤活性研究[j].中国药学杂志,2015,50(8):658-663.报道了建立系列分析方法对三叶青化学成分进行质量评价。均主要关注黄酮类和酚酸类成分，对于其他成分的质量评价报道很少，尤其是针对不同产地的三叶青独特性成分的化学评价未见报道。

技术实现思路

1、为了解决目前三叶青的产地来源的鉴别，本发明提供了一种闽产三叶青饮片及其检测方法、以及产地鉴别方法。

2、本发明提供了闽产三叶青饮片，它含有如下5种苷类成分一种或两种以上的组合：

3、

4、其中，所述的三叶青来源于三叶青tetrastigma hemsleyanum diels&gilg块根。

5、所述的三叶青饮片中含有

6、citroside a 53.13～115.47μg·g-1、

7、benzyl-β-d-glucopyranoside 123.38～398.10μg·g-1、

8、(e)-4-[3'-(β-d-glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cy-clohexen-l-one 14.90～37.21μg·g-1、

9、aviculin 31.36～78.69μg·g-1、

10、2-(4-hydroxy-3-methoxyp-henyl)ethyl-β-d-glucopyranoside322.98～542.65μg·g-1。

11、本发明提供了一种检测所述的闽产三叶青饮片的方法，它是采用hplc-ms检测所述的5种苷类成分。

12、其中，色谱条件为：

13、cortecs uplc c18色谱柱(2.1mm×100mm,1.6μm)；流动相乙腈(a)-0.1％甲酸水(b)，梯度洗脱程序如下：0-0.5min，15％(a)；0.5-3.5min，15-40％(a)；3.5-4.0min，40％；4.0-4.1min，80％(a)；4.1-4.5min，80％(a)；流速为0.25ml·min-1，柱温40℃；进样量2μl；

14、质谱条件为：

15、电喷雾正、负离子切换多反应监测(mrm)模式；毛细管电压3.5kv(正离子模式)、-2.5kv(负离子模式)；脱溶剂气流：氮气800l·h-1；脱溶剂温度：500℃；锥孔气流：氮气50l·h-1；离子源温度：150℃；extractor：3.00v；碰撞气体：氩气，其他参数见下表：

16、

17、进一步地，所述的检测方法包括如下步骤：

18、a、供试品溶液的制备：

19、取三叶青粉末，置于具塞锥形瓶中，取80％甲醇置于三叶青粉末锥形瓶中，密塞，超声提取30min，混匀，离心10min(10000rpm/min)，取上清液稀释，通过注射器将溶液用0.22μm滤膜过滤到进样小瓶中；用于定量分析前：将续滤液与甘草苷内标按1：1(500μl：500μl)比例混匀后进样测定；所述的超声条件为：功率250w，频率50khz；

20、b、对照品溶液的制备：

21、用百万分之一精密分析天平分别精密称取citroside a、benzyl-β-d-glucopyranoside 、 (e)-4-[3'-(β-d-glucopyranosyl-oxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl -2-cyclohexen-l-one、 aviculin、2-(4-hydroxy-3-methoxyp-henyl)ethyl-β-d-glucopyranoside，精密量取甲醇制备质量浓度分别为0.7714、1.020、0.1547、0.160、1.716mg·ml-1的单一对照品母液，分别精密量取上述对照品母液适量至10ml量瓶中，加入50％甲醇定容，摇匀，即得以上成分的质量浓度分别为771.4、1020.00、154.7、160.00、1716ng·ml-1混合对照品，其他不同浓度的混合对照品用50％甲醇逐级稀释得到。内标is甘草苷配置浓度为50ng·ml-1；

22、c、按权利要求5所述的色谱条件进行检测。

23、本发明还提供了一种鉴别三叶青饮片产地的方法，它包括如下步骤：

24、a、取代检样品；

25、b、按权利要求4-6任意一项所述的检测方法检测5种苷类成分；

26、c、鉴别判断。

27、其中，c步骤所述的鉴别判断方法为：

28、当citroside a的含量在53μg·g-1以上时，为闽产三叶青；或

29、当benzyl-β-d-glucopyranoside的含量在123μg·g-1以上时，为闽产三叶青；或

30、当aviculin的含量在31μg·g-1以上时，为闽产三叶青。

31、进一步优选地，c步骤所述的鉴别判断方法为：

32、检测的5种苷类成分的含量在以下范围内，即判定为闽产三叶青：

33、itroside a 53.13～115.47μg·g-1、benzyl-β-d-glucopyranoside123.38～398.10μg·g-1 、 (e)-4-[3'-(β-d-glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cy-clohexen-l-one

34、14.90～37.21μg·g-1、aviculin 31.36～78.69μg·g-1、2-(4-hydroxy-3-methoxyp-henyl)ethyl-β-d-glucopyranoside 322.98～542.65μg·g-1。

35、本发明前期通过对三叶青化学成分分离纯化，首次发现并鉴定其具有比较丰富的苯甲醇苷类、苯乙醇苷类、苯丙素苷类等苯苷类成分以及独特的倍半萜苷类成分，并以其中3种苯苷类成分(benzyl-β-d-glucopyranoside、aviculin、2-(4-hydroxy-3-met-hoxyphenyl)ethyl-β-d-glucopyranoside)和2种倍半萜苷类(citroside a、(e)-4-[3'-(β-d-glucopyra-nosyloxy)

36、butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one)的5种苷类成分为指标，基于uplc-qqq-ms/ms技术对不同批次、不同产地的三叶青进行定量分析，为三叶青苯苷类成分以及独特的倍半萜苷类成分的化学评价提供新的技术手段，并为不同的产地的三叶青标准的建立提供的新的依据。