一种基于普鲁士蓝纳米酶的多重检测干化学试纸及应用

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种基于普鲁士蓝纳米酶的多重检测干化学试纸及应用。

背景技术：

1、人体血液中尿酸、葡萄糖、胆固醇等代谢标志物的定量对于评估慢性和急性肾损伤、糖尿病、血脂异常等慢性疾病的进展和治疗效果具有重要意义。由于评估慢性疾病进展需要经常测试，而传统的基于实验室的诊断测试往往需要笨重的设备、繁琐的样本采集和专业的操作，既费时又不方便，对患者极不友好，因此开发出可以对这些疾病状况进行持续的监测设备是非常有帮助的。近年来，即时检测作为一种操作简单、检测快速、综合成本低的检测平台，逐渐成为了传统检测平台的替代品。干化学试纸是一种具有高度集成性特性的即时检测平台，常用于对代谢标志物进行简单便捷的定量检测。在一些生物分子的检测中，酶发挥了关键作用。然而，天然酶绝大多数是由蛋白质构成，而蛋白质的提取工艺繁琐、成本高昂、产量较低，并且最终产物在恶劣的外界环境下不稳定，极易发生变性从而失去酶活性，这些缺点制约了天然酶的实际应用。纳米酶的发现打破了这个僵局，与天然酶相比，纳米酶具有成本低、尺寸依赖性好、催化活性和稳定性高、表面修饰容易等独特性能。在工业化大批量生产中，纳米酶制备方便、批间差易控制、热稳定性好，这些特性为其在试纸中的应用提供了良好的性能。

2、目前市面上大多数试纸只能对单一指标进行检测，用户需要多次取血操作才能获得多个指标的检测结果，多重检测试纸将多个代谢指标集成在一张试纸上，大大提升了用户体验感。同时，纳米酶的应用使得制作出来的试纸更易储存并且一次检测多个指标的成本更低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于普鲁士蓝纳米酶的多重检测干化学试纸及应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于普鲁士蓝纳米酶的多重检测干化学试纸，包括底板、三个并列的反应层、过滤层和扩散层并依次堆叠；所述底板开有三个检测孔，三个检测孔分别对应三个并列的反应层；

3、尿酸反应液：向超纯水中依次加入磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸和防腐剂至终浓度分别为0.05～0.2m、0.05～0.2m、1～5μm、1～5μm和5～10μm，充分溶解后，加入表面活性剂和黏附剂至终浓度分别为0.5～2μm和1～10μm，调节ph为酸性后，再加入普鲁士蓝纳米酶、尿酸氧化酶和显色剂至终浓度分别为1～2mg/ml、200～600u/ml和1～10mg/m l，配制成尿酸反应液；

4、葡萄糖反应液：向超纯水中依次加入柠檬酸一水合物、柠檬酸二水合钠、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸和防腐剂至终浓度分别为0.01～0.05mm、0.05～0.1mm、1～5μm、1～5μm和5～10μm，充分溶解后，加入表面活性剂和黏附剂至终浓度分别为0.5～2μm和1～10μm，调节ph为酸性后，再加入普鲁士蓝纳米酶、葡萄糖氧化酶和显色剂至终浓度分别为0.1～1mg/ml、100～300u/ml和1～10mg/ml，配制成葡萄糖反应液；

5、胆固醇反应液：向超纯水中依次加入磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸和防腐剂至终浓度分别为0.05～0.2m、0.05～0.2m、1～5mm、1～5mm和5～10mm，充分溶解后，加入表面活性剂和黏附剂至终浓度分别为0.5～2μm和1～10μm，调节ph为酸性后，再加入普鲁士蓝纳米酶、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和显色剂至终浓度分别为0.1～5mg/ml、10～100u/ml、20～200u/ml和1～10mg/ml，配制成胆固醇反应液；

6、所述三个并列的反应层分别为含有尿酸反应液的反应层、含有葡萄糖反应液的反应层和含有胆固醇反应液的反应层。

7、进一步地，所述防腐剂包括苯甲酸钠；所述表面活性剂包括triton-x-100；所述黏附剂包括聚(甲基乙烯醚-alt-马来酸酐)；

8、配制尿酸反应液中，所述调节ph为酸性具体调节ph为4.5～6.5；

9、配制葡萄糖反应液中，所述调节ph为酸性具体调节ph为4.5～5.3；

10、配制胆固醇反应液中，所述调节ph为酸性具体调节ph为4.0～6.0。

11、进一步地，所述配制成尿酸反应液中的磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸、防腐剂、表面活性剂、黏附剂、普鲁士蓝纳米酶、尿酸氧化酶和显色剂在总体系中的终浓度依次为3.8mg/ml、10.2mg/ml、2.5m/ml、0.1mg/ml、0.1mg/ml、1.5μm、4.6μm、1.6mg/ml、400u/ml和2mg/ml；

12、所述配制成葡萄糖反应液中的柠檬酸一水合物、柠檬酸二水合钠、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸、防腐剂、表面活性剂、黏附剂、普鲁士蓝纳米酶、葡萄糖氧化酶和显色剂在总体系中的终浓度依次为7.0mg/ml、19.6mg/ml、2.5m/ml、0.1mg/ml、0.1mg/ml、1μm、4.6μm、0.6mg/ml、200u/ml和4mg/ml；

13、所述配制成胆固醇反应液中的磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、牛血清蛋白、乙二胺四乙酸、防腐剂、表面活性剂、黏附剂、普鲁士蓝纳米酶、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶和显色剂在总体系中的终浓度依次为3.8mg/ml、10.2mg/ml、2.5m/ml、0.1mg/ml、0.1mg/ml、1μm、4.6μm、1mg/ml、50u/ml、100u/ml和4mg/ml。

14、进一步地，所述显色剂为显色剂ⅰ和显色剂ⅱ组合；所述显色剂ⅰ为4-aap；所述显色剂ⅱ为maos、toos、tops、ados、adps、alps、daos、hdaos和madb中的一种。

15、进一步地，所述显色剂ⅰ和显色剂ⅱ的质量比为1:1。

16、进一步地，所述显色剂为4-aap和maos组合。

17、进一步地，三种反应液在反应层上的含量为：尿酸反应液为11.67μl/cm2，葡萄糖反应液为8.33μl/cm2，胆固醇反应液为10μl/cm2。

18、进一步地，所述过滤层经过泡膜液浸泡并干燥；所述泡膜液为含有nacl和山梨醇的水溶液。

19、根据权利要求上述的一种基于普鲁士蓝纳米酶的多重检测干化学试纸在检测尿酸、葡萄糖和胆固醇中的应用。

20、进一步地，所述检测尿酸、葡萄糖和胆固醇具体为：将样品滴加在所述反应层上，在室温下进行反应；反应完全后，使用终端设备获取所述反应层上的显色图像，并用比色软件读取图像的平均rgb值；以b/(r+g+b)为纵坐标，以尿酸浓度、葡萄糖浓度、胆固醇浓度为横坐标，对检测结果进行线性拟合；根据得到的拟合曲线的回归方程计算血清中尿酸、葡萄糖、胆固醇含量；

21、所述比色软件包括colorassist、color comparator和colorpicker；

22、尿酸拟合曲线为b/(r+g+b)＝0.023×c[ua]+0.331；葡萄糖拟合曲线为b/(r+g+b)＝0.002×c[glu]+0.348；胆固醇拟合曲线为b/(r+g+b)＝0.003×c[tc]+0.368。

23、本发明的有益效果是：

24、(1)本发明基于普鲁士蓝纳米酶构建的干化学试纸将三种常见慢性病标志物集成到一张试纸条上，不仅缩减了一次检测多个指标的成本和时间，同时避免用户多次取血操作，检测体验更好。

25、(2)本发明选用普鲁士蓝纳米酶代替天然辣根过氧化物酶，相对于利用天然酶检测，成本更低，稳定性更好，制作出来的试纸更易储存，适用性更强。