一种检测链霉素的比率型荧光适配体传感器的制备方法

本发明提供一种检测链霉素的比率型荧光适配体传感器的制备方法，属于食品安全检测。

背景技术：

1、链霉素（str）是用于治疗由革兰氏阴性杆菌感染引起疾病的重要氨基糖苷类抗生素。然而，str的滥用可能会在动物源性食品中残留，通过食物链传播给人类引起耳毒性和肾毒性等严重的副作用，甚至导致细菌变异和抗生素耐药性。因此，建立快速、灵敏、准确的str残留检测方法是至关重要的。目前，高效液相色谱、微生物检测、酶联免疫和比色传感器等灵敏检测方法已用于检测牛奶中str的残留，但这些方法由于检测时间长，步骤繁琐，设备昂贵和技术水平要求高等弊端限制了它们的应用。

技术实现思路

1、发明的目的在于需求一种快速、准确、方便和灵敏的检测技术检测牛奶中的str。

2、其技术方案为：适配体是通过指数富集的配基系统进化技术（selex）从随机文库中获得对目标物质具有高亲和力的单链dna或rna片段。因具有体外合成容易、免疫原性低、稳定性高等优势，在食品安全分析、环境监测和药物靶点筛选中得到广泛应用。

3、所述的一种检测牛奶中str的适配体的筛选（图1），其特征在于：采用磁性氧化石墨烯（mgo）-selex筛选str特异性适配体（apt）。基于高通量测序结果、二级结构和分子模拟对接合理截断，保留了与str结合的长茎部分。用荧光标记法比较了截断前后适配体对str的结合亲和力，根据解离常数（kd）选择与str亲和力最强的适配体作为传感器的识别元件。

4、所述的一种检测牛奶中str的比率型荧光适配体传感器的制备方法（图2），其特征在于：参比信号是适配体功能化的碳量子点（cqds），它发出绿色荧光。响应信号是脱脂奶粉（smp）蛋白介导和沸石咪唑骨架-8（zif-8）封装的agncs-smp@zif-8。zif-8既可以利用金属有机材料的刚性框架在一定方向上空间分离agncs，提高agncs的发光性能和稳定性；又因其多孔结构能够吸附积累的淬灭剂铜离子（cu2+）快速穿透zif-8的孔隙，与agncs形成粒径较大的团聚体，同时与agncs模板谷胱甘肽结合淬灭荧光，确保了纳米复合材料的红色荧光信号对cu2+的响应更快。综上所述，我们建立了一种检测str的比率荧光检测方法。2+无法淬灭，传感器具有双发射荧光信号。存在str时，str与zif-8之间的竞争削弱了π-π堆积，导致cqds-apt与agncs-smp@zif-8解离，cu2+穿透zif-8形成团聚体，并与谷胱甘肽结合淬灭agncs-smp@zif-8荧光信号，荧光信号的比率变化可以实现str的定量检测。

5、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：agncs-smp@zif-8的制备，首先，将50mm谷胱甘肽溶解至4.8 ml超纯水中，在室温磁力搅拌下加入125 μl硝酸银溶液（20 mm），用氢氧化钠溶液调节ph至9.0。随后，将5 mg的α-硫辛酸溶解在100 mm的硼氢化钠溶液中，并剧烈搅拌，直到观察到溶液透明后立即将其加入上述银混合物中，混合搅拌30 min后，在室温下孵育2 h。所得到的agncs与6 ml smp（10 mg/ml）混合孵育1 h后，与10 ml六水硝酸锌溶液（35 mm）室温下混合搅拌5 min。接着，加入10 ml的2-甲基咪唑溶液（280 mm）持续搅拌24 h。将得到的乳白色混合物溶液6500 rpm离心10 min后洗涤三次。最后，合成的agncs-smp@zif-8避光保存在4°c中。

6、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：在检测str之前，需要将合成的1 μm的cqds-apt52探针溶液（以dna浓度为参考）与225 μl的agncs-smp@zif-8（40 μm）在4°c下孵育过夜。然后，将一系列不同浓度的str溶液（1 nm，10 nm，25 nm，50 nm，100 nm，200 nm，300 nm，400 nm和500 nm）分别加入到agncs-smp@zif-8/cqds-apt52溶液中，混合物在37°c混合孵育3 h。然后加入50 μl的cu2+溶液反应90 s后移至微量比色皿中，在激发波长425nm，狭缝宽度为5nm时，采集450~800nm范围内的荧光发射光谱。

7、所述适配体传感器的制备工艺如下：预处理前，牛奶样品分别添加20 nm、100 nm和200 nm的str（20 nm、100 nm和200 nm）。然后，用以下方法对样品进行预处理。首先，将3份4 ml添加靶标的牛奶样品分别加入16 ml甲醇，在-20℃冷冻20 min后12000 rpm下离心15 min以去除沉淀。上清液通过0.22 μm的滤膜，滤液在60°c下干燥，剩余的溶液用氮气干燥。用超纯水悬浮后再次通过0.22 μm的滤膜，将所得溶液的体积设置为4 ml。

技术特征：

1.一种检测牛奶中链霉素的比率型荧光适配体传感器的制备方法，其特征在于：利用磁性氧化石墨烯（mgo）-selex筛选截断获得的链霉素（str）特异性适配体apt52为识别元件，构建了一种基于cqds和agncs-smp@zif-8的新型比率型荧光适配体传感器，用于检测str。

2.如权利要求1所述的一种检测牛奶中链霉素的比率型荧光适配体传感器的制备方法，其特征在于：利用mgo-selex筛选截断获得str特异性适配体，根据分子模拟对接结合位点截断获得str高亲和力适配体apt52。

3.如权利要求1所述的一种检测牛奶中链霉素的比率型荧光适配体传感器的制备方法，其特征在于：利用cu2+与zif-8之间电子转移和聚集诱导，避免在相对较短的波长范围内猝灭cqds的荧光信号，在相同的激发波长下通过agncs-smp@zif-8和cqds的荧光信号比值变化实现对str的检测。

4.如权利要求1所述的一种检测牛奶中链霉素的比率型荧光适配体传感器的制备方法，其特征在于：该传感器具有较好的传感性能，可实现检测实际牛奶样品中str残留。

技术总结
本发明提供了一种检测牛奶中链霉素的比率型荧光适配体传感器制备方法，属于食品安全检测领域。本发明包括链霉素（STR）特异性适配体的筛选和比率型荧光传感器构建。首次采用磁性氧化石墨烯筛选技术获得STR适配体（Apt），根据二级结构和分子模拟对接分析结合位点，截断获得与靶标亲和力最佳的Apt52。利用Apt52修饰的碳量子点（CQDs）为参比信号，AgNCs‑SMP@ZIF‑8为响应信号构建荧光传感方法判定被检样中是否含有链霉素。适配体特异性结合靶标导致AgNCs‑SMP@ZIF‑8暴露快速吸附大量Cu2+富集，AgNCs‑SMP@ZIF‑8的荧光信号被猝灭，CQDs的荧光信号始终保持稳定，通过AgNCs‑SMP@ZIF‑8和CQDs的荧光信号比值变化检测链霉素残留。该传感器对STR的检测限为0.978 nM，具有令人满意的特异性和灵敏度。

技术研发人员：李发兰,张皖齐,孙志聪,孙霞,郭业民,杨青青,张妍妍
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21