一种循环肿瘤细胞EGFR免疫显色检测试剂的制作方法

本发明属于分子生物学，具体而言，本发明涉及一种循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂。

背景技术：

1、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，ctc）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因ctc检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

2、本发明人前期已设计了一系列用于对ctc进行分离（例如， cn202310581431.0，“基于微流控芯片的ctc细胞检测方法及其系统”；cn202310671592.9，“适用于循环肿瘤细胞捕捉的微流控芯片及其方法”；cn202310581433.x，“基于微流控芯片的ctc细胞分离控制方法及其系统”等）、检测（cn202211359933.0，“循环肿瘤细胞检测设备及其方法”；cn202310065947.x，“基于分光光谱的肿瘤细胞检测设备及其方法”等）、荧光成像（cn202310581410.9，“基于fish的细胞检测系统及其方法”；cn202310671490.7，“荧光显微成像系统及其方法”等）的设备和方法。然而，对于如何高效分离与富集ctc细胞，仍有待研究。鉴于此，本发明人开发了一种上皮间质混合型及pd-l1阳性循环肿瘤细胞的富集检测方法（cn201910506524.0），该方法利用上皮间质特异性捕获与检测抗体标志物、特异性免疫检查点抗体标志物与捕获增强液与染色增强液组合结合微流控技术，不仅可以简捷高效特异地富集检测上皮间质混合型ctc而且可以富集检测上皮型与间质型ctc。然而，该专利中使用了多种抗体的组合，成本较高，操作也相对复杂，仍需要开发改进的ctc检测方法。

3、表皮生长因子受体(vascular endothelial cell growth factor, egfr)属于酪氨酸激酶受体家族，癌细胞中egfr的异常激活可由多种机制诱导，包括基因扩增、点突变、缺失和自分泌配体受体刺激等，通过建立非炎性的肿瘤微环境，降低cd8+t细胞活性，增强treg细胞的免疫抑制功能，从而促进肿瘤的发生和进展。

4、检测肿瘤患者中egfr的异常表达对于诊断肿瘤、转移和患者预后具有重要意义。然而目前临床实践中，肿瘤患者egfr检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此检测循环肿瘤细胞上的egfr异常表达是一种有前景的诊断和预后方法。然后目前市面上仍缺少这样的检测试剂。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂，其包括能够与循环肿瘤细胞的表面egfr特异性结合的抗体或其抗原结合片段、聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球和可检测标记物。

2、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段通过聚酰胺-胺树枝状大分子与磁性微球相连。

3、进一步地，所述可检测标记物通过聚酰胺-胺树枝状大分子与磁性微球相连。

4、进一步地，所述可检测标记物选自荧光物质、酶、量子点中的一种或几种。优选地，所述可检测标记物为异硫氰酸荧光素。

5、进一步地，本发明提供了所述免疫显色检测试剂的制备方法，其包括以下步骤：

6、（1）制备聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球，

7、（2）将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球与链霉亲和素在戊二醛存在的条件下进行反应，得到链霉亲和素化的磁性微球，

8、（3）将链霉亲和素化的磁性微球与可检测标记物连接，得到可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球，

9、（4）将可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球与生物素化的能够与循环肿瘤细胞的表面egfr特异性结合的抗体或其抗原结合片段连接，得到所述循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂。

10、进一步地，步骤（1）包括：s1.将fe3o4磁性微球分散在碱性缓冲液中，加入盐酸多巴胺于室温搅拌孵育6-12h，用磁铁从反应液分离出聚多巴胺包被的磁性微球并进行洗涤、干燥；s2.将聚多巴胺包被的磁性铁颗粒分散在碱性缓冲液中，加入聚酰胺-胺溶液于30℃搅拌孵育6-12h，用磁铁从反应液分离出聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球并进行洗涤、干燥。

11、进一步地，步骤（2）包括将聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球经戊二醛活化后，分散在磷酸盐缓冲液中，然后加入链霉亲和素溶液，20-30℃振荡反应20-30h，用磁铁从反应液分离出链霉亲和素化的磁性微球并进行洗涤。

12、进一步地，步骤（3）包括将链霉亲和素化的磁性微球分散在磷酸盐缓冲液中，加入可检测标记物的dmso溶液，在保护气体下避光反应12-16h，用磁铁从反应液分离出可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球并进行洗涤。

13、进一步地，步骤（4）包括将可检测标记物标记的链霉亲和素化磁性微球分散在包含生物素化的能够与循环肿瘤细胞的表面egfr特异性结合的抗体或其抗原结合片段的磷酸盐缓冲液中，于4-8℃振荡孵育12-48h，然后加入含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液于4-8℃振荡孵育1-2h以封闭潜在的蛋白结合位点，用磁铁从反应液分离出附着所述抗体或其抗原结合片段的可检测标记物标记的磁性微球（即本文所述循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂）、洗涤并储存于磷酸盐缓冲液中。

14、进一步地，所述洗涤为用磷酸盐缓冲液洗涤。进一步地，所述干燥包括在50-70℃下真空干燥。

15、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如seq id no：1、2和3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包含分别如seq id no：5、6和7所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。

16、进一步地，所述重链可变区具有如seq id no：4所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区具有如seq id no：8所示的氨基酸序列。

17、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、fab、fab’、fv片段、f(ab’)2、scfv或di-scfv。

18、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段为scfv。

19、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头。

20、进一步地，所述接头具有如seq id no：9所示的氨基酸序列。

21、进一步地，所述抗体或其抗原结合片段具有如seq id no：10所示的氨基酸序列。

22、本发明还提供了如本文所述的免疫显色检测试剂用于分离和富集egfr阳性循环肿瘤细胞的用途。这可以简单地通过以下步骤实现：使如本文所述的免疫显色检测试剂与来自受试者的包含ctc的外周血或血浆在适合抗原-抗体复合物形成的条件下孵育，然后利用磁铁从混合物分离出磁性微球，即得到富集的egfr阳性循环肿瘤细胞。

23、本发明的有益效果

24、本发明提供的特定的与循环肿瘤细胞的表面egfr特异性结合的抗体或其抗原结合片段对egfr具有极高的亲和力，并且对其他抗原具有较低的交叉反应性，具备优异的特异性和灵敏度。

25、本发明进一步将所述抗体与聚酰胺-胺树枝状大分子修饰的磁性微球、可检测标记物结合起来用作循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂，其通过所述抗体与ctc表面egfr特异性结合，通过磁性微球的中转实现对细胞表面egfr信号的倍数放大，从而实现对ctc表面egfr的高灵敏度检测。

26、本发明的循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂解决了在ctc富集阶段常常需要依赖免疫抗体的技术问题，显著节省了成本，简化了操作。此外，本发明的循环肿瘤细胞egfr免疫显色检测试剂也可用于对ctc进行富集，同时实现对ctc的检测，具有双重功效。