用于标记成像的染色透明一步式封片剂、封片方法及应用

本发明涉及了生物样品处理和生物医学成像领域，具体涉及了一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂、封片方法及应用。

背景技术：

1、细胞核荧光染色是一种通过荧光染料标记细胞核的技术，使细胞核在显微镜下呈现出荧光信号，从而能够清晰地观察和研究细胞核的结构和功能。常用的荧光染料包括荧光素和类似物，如草酰胺鸟嘌呤(dapi)、乙啶溴化铯(eb)、氟孔雀石绿(hoechst)以及碘化丙啶(pi)等。这些染料可以与dna结合并发出荧光信号，以清晰可见细胞核的轮廓。细胞核荧光染色技术的发展使研究者能够更准确地观察和研究细胞核的结构和功能，以及其在生理和病理条件下的变化。因此在生命科学研究中，这项技术得到了广泛的应用。

2、然而，目前存在着一些问题，例如荧光标记的信号噪声较高、染色效果不稳定、染色处理时间较长以及染色后进一步处理对染色结果的影响等。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中的问题，本发明提供了一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂、封片方法及应用，能够对生物组织进行快速、无损的细胞核染色标记的同时进行光学透明，以缩短常规核染色过程的处理流程和时间消耗，并有助于获得更高质量的成像效果。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一、一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂：

4、包括溶剂、碘化丙啶染液、间苯二甲胺和山梨糖醇，所述溶剂为磷酸缓冲液和二甲基亚砜的混合溶液。

5、所述封片剂是将碘化丙啶染液、间苯二甲胺和山梨糖醇加入到所述溶剂中制备得到。

6、所述间苯二甲胺和溶剂的体积比为0.1～0.3:1，所述山梨糖醇和溶剂的质量体积比100g～300g:1l，所述碘化丙啶染液和溶剂的体积比为0.001～0.05:1，所述溶剂中二甲基亚砜和磷酸缓冲液的体积比为1:3～7.5。

7、二、一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法：

8、1)将生物组织进行固定和分离操作后切片得到生物组织切片；

9、2)将生物组织切片浸泡在所述的封片剂中同时进行透明和染色，再根据生物组织切片的厚度进行孵育；

10、3)对孵育后的、生物组织切片利用前面已加入留在里面的封片剂进行封片；

11、4)将封片后的生物组织切片进行成像。

12、对有特异性标记、组织免疫荧光标记、免疫组化标记、染料标记、h&e染色等需求的生物组织切片，在所述步骤2)之前对所述步骤1)得到的生物组织切片进行特异性标记、组织处理。

13、所述步骤1)中的生物组织切片厚度适用范围为0～1000μm，优选的切片厚度为0～400μm。

14、所述步骤1)中的生物组织为脑、心脏、肺组织、脾脏、肝脏或者肾脏。

15、所述步骤1)中的生物组织来源于爬行类、鸟类和哺乳类动物生物体。

16、所述步骤2)中的浸泡在恒定温度和振荡情况下进行，优选的温度为20-40摄氏度，优选的振荡速度为20-80rpm/min。

17、所述步骤3)中的封片通常采用与生物组织厚度匹配的垫片和载玻片、盖玻片封片。

18、步骤4)中所述的成像适用于多种光学显微镜，包括宽场荧光显微镜、激光片层扫描显微镜、激光共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜。

19、三、一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂在双光子和共聚焦成像中的应用。

20、本发明结合了组织光透明技术和细胞核荧光染色技术，大大简化了组织样本处理过程，快速实现对较厚组织的染色封片，组织光透明技术能够通过去除生物组织内部的脂质、水、色素等，减弱生物组织对光的散射和吸收，从而提高光学显微镜的成像深度，并清晰呈现了深层组织的荧光图像。通过结合细胞核荧光染色和组织光透明技术，实现了较厚组织一步式快速染色后封片观察。

21、本发明的有益效果是：

22、1、本发明所使用的试剂成分简单，成本较低。

23、2、本发明所使用的试剂浸泡只需要一步，无需洗掉染色操作后的多余染料，简单易行，适用性广。

24、3、本发明所使用的试剂有利于较厚组织快速标记成像。

技术特征：

1.一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂，其特征在于：包括溶剂、碘化丙啶染液、间苯二甲胺和山梨糖醇，所述溶剂为磷酸缓冲液和二甲基亚砜的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂，其特征在于：

4.一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法，其特征在于，方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法，其特征在于：

6.根据权利要求4所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法，其特征在于：

7.根据权利要求4所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法，其特征在于：

8.根据权利要求4所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法，其特征在于：

9.根据权利要求4所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的封片方法，其特征在于：

10.根据权利要求1所述的一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂的应用，其特征在于：在双光子和共聚焦成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于标记成像的染色透明一步式封片剂、封片方法及应用。封片剂是将碘化丙啶染液、间苯二甲胺和山梨糖醇加入到所述溶剂中制备得到，间苯二甲胺和溶剂的体积比为0.1～0.3:1，山梨糖醇和溶剂的质量体积比100g～300g:1L，碘化丙啶染液和溶剂的体积比为0.001～0.05:1，溶剂中二甲基亚砜和磷酸缓冲液的体积比为1:3～7.5。应用为在双光子和共聚焦成像中的应用，本发明能对生物组织同时进行标记和透明化，大大缩短组织样品标记透明处理所需时间，且对生物组织本身荧光成像无影响。

技术研发人员：斯科,王子筝,肖啸,韩一萍,龚薇
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16