一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法

本申请涉及蛋白质浓度检测，特别涉及一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法。

背景技术：

1、蛋白质是一种有机大分子，是人体的重要组成成分，存在于人体的每一个细胞和每一种组织中。蛋白质种类繁多，按照人体中蛋白质含量多少可以将蛋白质分为高丰度蛋白和低丰度蛋白。高丰度蛋白指的是含量较高的蛋白质，血液中14种高丰度蛋白占血液中蛋白总量的95％，其定量分析相对较容易。低丰度蛋白在血液中含量较低，但是对人体的健康起着非常重要的作用，是临床诊断各种疾病的重要指标，对其进行定量和定性分析具有重要意义。

2、然而，血清中高丰度蛋白含量高丰度蛋白容易掩盖低丰度蛋白的信息，要想分析低丰度蛋白含量必须将其分离出来，并用灵敏度高的检测器对其进行定量分析。目前通常采用数字免疫技术(如simoa微孔阵列芯片技术)对低丰度蛋白进行检测，虽然具有较高的灵敏度，但是其需要制造专用的微流控芯片和专用的检测设备，制造工艺复杂，成本高昂。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述问题，本申请提供一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，能够在保证较高灵敏度的同时降低检测成本。具体技术方案如下：

2、本申请提供一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，包括如下步骤：

3、提供编码磁珠，所述编码磁珠是基于抗体和磁珠偶联得到的；

4、向所述编码磁珠中投入含有抗原的待测物，得到第一中间产物，所述第一中间产物是基于所述编码磁珠上的抗体和所述抗原结合得到的；

5、向所述第一中间产物中加入生物素化抗体，得到第二中间产物，所述生物素化抗体分子中的单个抗体与多个生物素分子结合，所述第二中间产物是基于所述第一中间产物上的抗原和所述生物素化抗体上的抗体结合得到的；

6、向所述第二中间产物中加入链霉亲和素化探针模板链，得到第三中间产物，所述链霉亲和素化探针模板链中的单个链霉亲和素分子与多个探针模板链结合，所述第三中间产物是基于所述第二中间产物上的生物素分子与链霉亲和素化探针模板链上的链霉亲和素分子结合得到的；

7、向所述第三中间产物中加入荧光探针，得到待测复合物，所述待测复合物是基于所述荧光探针与所述第三中间产物上的探针模板链结合得到的，单个所述探针模板链上能够结合多个荧光探针；

8、采用流式细胞仪对所述待测复合物进行荧光检测，并基于得到的荧光检测结果确定所述待测物的蛋白浓度。

9、可能的实施方式中，所述向所述第三中间产物中加入荧光探针，得到待测复合物的步骤中：

10、向所述第三中间产物中加入荧光探针后，对所述第三中间产物和荧光探针的混合物进行孵育，其中，采用的孵育时长为0.75-2h。

11、可能的实施方式中，所述编码磁珠的制备过程，包括如下步骤：

12、提供活化磁珠；

13、向所述活化磁珠中加入抗体溶液，孵育，得到表面偶联有抗体的磁珠；

14、对所述表面偶联有抗体的磁珠进行封闭处理，得到编码磁珠。

15、可能的实施方式中，制备所述表面偶联有抗体的磁珠采用的孵育温度为25-40℃。

16、可能的实施方式中，所述链霉亲和素化探针模板链的制备过程，包括如下步骤：

17、将链霉亲和素和偶联剂混匀、孵育，得到链霉亲和素偶联物；

18、向所述链霉亲和素偶联物中加入探针模板链、混匀孵育，得到链霉亲和素化探针模板链。

19、可能的实施方式中，所述链霉亲和素和所述偶联剂的摩尔比为1:(15-25)。

20、可能的实施方式中，所述链霉亲和素和所述探针模板链的摩尔比为1:(1.5-2.5)。

21、可能的实施方式中，满足如下特征中的至少之一：

22、所述链霉亲和素偶联物的制备所需的孵育温度为2-8℃；

23、所述链霉亲和素偶联物的制备所需的孵育时间为0.2-1h。

24、可能的实施方式中，所述将链霉亲和素偶联物中加入探针模板链、混匀孵育的步骤中，采用的孵育温度为2-8℃。

25、可能的实施方式中，所述将链霉亲和素偶联物中加入探针模板链、混匀孵育的步骤中，采用的孵育时间为12-18h。

26、基于上述技术方案，本申请具有以下有益效果：

27、本申请提供一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，包括如下步骤：提供编码磁珠，编码磁珠表面偶联有抗体；向编码磁珠中投入含有抗原的待测物，抗原与编码磁珠表面的抗体结合，得到第一中间产物；向第一中间产物中加入生物素化抗体，单个抗体与多个生物素分子结合得到生物素化抗体，第一中间产物上的抗原与生物素化抗体分子上的抗体结合，得到第二中间产物，完成一重荧光信号放大；向第二中间产物中加入链霉亲和素化探针模板链，单个链霉亲和素分子与多个探针模板链结合得到链霉亲和素化探针模板链，第二中间产物上的生物素分子与链霉亲和素化探针模板链上的链霉亲和素分子结合，得到第三中间产物，完成二重荧光信号放大；向第三中间产物中加入荧光探针，第三中间产物上的探针模板链与荧光探针结合，得到待测复合物，单个探针模板链上能够结合多个荧光探针，完成三重荧光信号放大；采用流式细胞仪对上述待测复合物进行荧光检测，并基于得到的荧光检测结果确定所述待测物的蛋白浓度。通过上述步骤，完成三重荧光信号放大，使得一分子抗原对应多个荧光探针的信号，再配合流式细胞仪进行检测，能够检测出血液样本中与某些疾病相关的低丰度蛋白质的浓度。一方面，不需要制作专用的微流控芯片和专用的检测设备，使用流式细胞仪即可进行分析检测，也不需要对血样样本进行富集处理，样本需求量小，检测成本较低；另一方面，在保证准确性的同时将最低检出限提高至飞克级别，检测灵敏度高。

技术特征：

1.一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1中所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述向所述第三中间产物中加入荧光探针，得到待测复合物的步骤中：

3.根据权利要求1所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述编码磁珠的制备过程，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，制备所述表面偶联有抗体的磁珠采用的孵育温度为25-40℃。

5.根据权利要求1-4中任一所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述链霉亲和素化探针模板链的制备过程，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述链霉亲和素和所述偶联剂的摩尔比为1:(15-25)。

7.根据权利要求5所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述链霉亲和素和所述探针模板链的摩尔比为1:(1.5-2.5)。

8.根据权利要求5所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，满足如下特征中的至少之一：

9.根据权利要求5所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述将链霉亲和素偶联物中加入探针模板链、混匀孵育的步骤中，采用的孵育温度为2-8℃。

10.根据权利要求5所述的一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法，其特征在于，所述将链霉亲和素偶联物中加入探针模板链、混匀孵育的步骤中，采用的孵育时间为12-18h。

技术总结
本申请涉及蛋白质浓度检测技术领域，特别涉及一种采用流式细胞仪检测蛋白质浓度的方法。本申请通过生物素化抗体、链霉亲和素化探针模板链和荧光探针，对目标蛋白质进行三重荧光信号放大，使得一分子目标蛋白质对应多个荧光探针的信号，再配合流式细胞仪进行检测，能够检测出样本中低丰度蛋白质的浓度。不需要制作专用的微流控芯片和专用的检测设备，使用流式细胞仪即可进行分析检测，检测成本较低，在保证准确性的同时将最低检出限提高至飞克级别，检测灵敏度高。

技术研发人员：尹焕才,茹静,熊宝仪,殷建,陈名利,孙姣姣,刘杰
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10