专利名称:超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统，属于扫描显微成像领域。
背景技术：
在材料科学领域，大量研究结果表明物质在纳米尺度的尺寸效应、量子效应、表面效应等使得纳米材料与纳米器件展现出非常优异的性能。只有在纳米尺度深入研究纳米功能器件中表面与界面的物理化学过程以及不同表界面分子结构和性质的变化，了解纳米功能器件的工作机制，才能实现人工设计、制备具有特定性能纳米器件的科学目标。
生命科学中生化反应和生物分子结构与性能的研究更是如此，由于生物分子结构(如构象)的多样性、生化反应的非同步性和所处环境的非均一性，在纳米尺度实现生理条 件下蛋白质、核酸等单个生物分子成像表征，对揭示生命的奥秘、提高疾病的预防、诊断、治疗水平具有重要意义。
光学成像是最常用的成像表征技术，但是由于光学衍射原理的限制，传统光学显微镜只能达到波长量级的空间分辨率(一般在200nm-500nm)，限制了它在纳米尺度对分子结构和功能研究中的应用。2006年以来各国研究人员提出了光活化定位显微镜(PALM)、随机光学重构显微镜(STORM)、受激福射耗尽(Stimulated emission depletion-STED)显微镜等几种突破衍射极限的荧光成像新原理，其中STED显微镜以其时间分辨的优势在对动态过程的成像应用中具有很大的前景。
STED显微镜作为一种超分辨的共聚焦光学显微镜,是一种扫描成像技术，它是在传统共聚焦显微镜的基础上，添加一路STED光束，通过调制STED光束波前在物镜焦平面上形成空壳形状焦斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子转换为非辐射态，实现了好于50纳米的空间分辨率。目前超分辨的共聚焦光学显微镜的研究还处于起步阶段，与其他成像技术的联用尚未开展。
扫描探针显微镜(SPM)是二十世纪末发展起来的纳米表界面扫描显微成像技术。SPM具有很高的空间分辨率，能够在三维实空间下实时观察单个原子、分子在物质表面的状态并且研究与表面电子行为有关的物理及化学性质，已成为在原子分子尺度上研究表界面行为的最有力的手段之一。SPM技术包括基于表界面的电子态的扫描隧道显微技术、基于表面原子间相互作用力的原子力显微技术、基于电解液离子电流的离子电导显微技术等。
因为荧光成像可以定位特定的靶分子，将荧光成像技术与SPM技术联用，通过荧光成像引导SPM探针在样品表面特定位置进行形貌成像和多参量研究，既可以获得单分子的光学信号和形貌图像，又可以获得单对分子间相互作用的其它参量信息。但是由于光学衍射极限的限制，现有的激光共聚焦显微镜空间分辨率只能达到250nm — 300nm，难以实现复杂体系中纳米级光学成像，对SPM探针的弓I导定位也不够精确。
发明内容
[0008]本发明的目的是提供一种超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统，通过在共聚焦光学显微镜中加入第二路调制光，实现超分辨的共聚焦光学显微成像，突破传统的光学衍射极限的限制；本发明通过将SPM与超分辨的共聚焦光学显微系统结合，由于超分辨的共聚焦光学显微镜分辨率可接近SPM的分辨率，在获得单分子的光学信号和形貌图像的同时，可以获得单对分子间相互作用的其它参量信息，实现在纳米尺度和分子水平对复杂体系多参量成像和分析，还可以首先进行超分辨的光学显微成像，然后利用该高分辨的光学显微图像对SPM探针进行纳米级精确引导定位，实现特定靶点的SPM分析。
本发明所提供的一种超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统中，激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜,激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后汇聚至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜a收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；
经收集透镜汇聚后的激光入射至SPM探针的悬臂上，所述SPM探针设于所述样品台的上方；经所述SPM探针反射后的光经所述经收集透镜b收集后入射至SPM探测器，所述·SPM探测器输出的电信号输入至SPM信号采集器；
所述SPM探针和样品台均与一位移控制器相连接。
上述的联用系统中，所述激光器a输出的所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜，以调整光路对准。
上述的联用系统中，所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜a之前经过一反射镜，用于对准光路；所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜a之前经过一滤波片，用于滤除激发光。
上述的联用系统中，经所述SPM探针反射后的光经所述经收集透镜b收集后再经一半反半透镜后入射至SPM探测器。
上述的联用系统中，所述SPM探针具体可为STM探针、AFM探针、TERS金属探针或尚子电导探针。
本发明提供的超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统具有以下有益效果
I、在一套成像平台上同时实现光学成像与SPM成像，在获得单分子的光学信号和形貌图像的同时，可以获得单对分子间相互作用的其它参量信息。
2、同时成像克服了现在流行的二次成像带来的定位不准和信息变化的缺点。
3、由超分辨的光学成像引导SPM成像和分析，由于超分辨的共聚焦光学显微镜分辨率可接近SPM的分辨率，可以实现更高精度的靶点定位。
图I为本发明提供的联用系统的结构示意图。
图2为使用本发明提供的联用系统对荧光标记的纳米微球的原子力形貌图像(左)和超分辨共聚焦显微图像(右)。
图中各标记如下1激光器a、2 二向色性滤光片a、3,9反射镜、4显微物镜、5激光器b、6位相板、7 二向色性滤光片b、8样品台、10滤波片、11收集透镜a、12光电探测器、13光学信号采集器、14半反半透镜、15收集透镜b、16AFM探针、17SPM探测器、18SPM信号采集器、19位移控制器。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
本发明提供的超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统，
激光器al输出的激光经二向色性滤光片a2滤光后经反射镜3反射后汇聚至显微物镜4，激光器b5输出的激光依次经位相板6和二向色性滤光片b7滤光后经反射镜3反射后汇聚至显微物镜4 ;经过显微物镜4汇聚的激光照射至样品台8上，待测样品的荧光信号又经显微物镜4汇聚后经反射镜3、二向色性滤光片a2、二向色性滤光片b7、反射镜9、滤波片10和收集透镜all收集后入射至光电探测器12，光电探测器12输出的光电信号输入至光学信号采集器13 ;透射过半反半透镜14的激光经收集透镜bl5收集后入射至AFM探 针16的悬臂上，该AFM探针16设于样品台8的上方j^AFM探针16反射后的光经收集透镜bl5收集后入射至SPM探测器17，该SPM探测器17输出的电信号输入至SPM信号采集器18 ;本发明提供的联用系统中，AFM探针16和样品台8均与一位移控制器19相连接，用于控制AFM探针16和样品台8的移动。
上述的联用系统中，所用的SPM探针具体可选择为STM探针、AFM探针、TERS金属探针或离子电导探针等。
本发明提供的联用系统中，激发用激光器al经过二向色性滤光片a2、反射镜3反射入显微物镜4，经显微物镜4汇聚后，激发样品发射荧光；退激发用激光器b5，经过位相板6调整光束波前，经二向色性滤光片b7和反射镜3反射后，经显微物镜4汇聚后形成空壳型焦斑，将激发光激发的荧光斑周围荧光分子退激发，最后只有小体积的荧光分子自发辐射荧光，实现超分辨光学成像；样品台8在位移控制器19的控制下对样品进行扫描，获得不同位置的光学信号。荧光信号经显微物镜4收集后，经反射镜3和反射镜9反射后，由滤波片10滤除荧光以外的其它光，经收集透镜all汇聚后，由光电探测器12转换为电信号；由光电探测器12获得的光电信号，经过光学信号采集器13采集后，由计算机进行重构和处理获得超分辨荧光显微图像。
AFM探针16和样品台8在位移控制器19的统一控制下，实现样品的探针扫描，AFM信号经过半反半透镜14反射后由SPM探测器17转换为电信号，经过SPM信号采集器18采集后，由计算机进行重构和处理获得扫描探针显微图像。
AFM探针16由位移控制器19控制实现探针和光学焦斑的对准，然后位移控制器19控制样品台8扫描样品，实现超分辨光学成像和SPM成像的同步成像。光学信号采集器13和SPM信号采集器18由位移控制器19触发，实现同步采集。
使用上述联用系统对荧光标记的40纳米直径的纳米微球进行了超分辨共聚焦显微和原子力联用成像试验，通过原子力针尖与物镜焦点的精确对准，同时获得了图2所示原子力形貌图像(左)和超分辨共聚焦显微图像(右)，其中超分辨共聚焦显微图像的分辨率已经达到50nm的横向空间分辨率，远远超过传统的共聚焦显微镜。
权利要求
1.超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统，其特征在于 激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜,激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后入射至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜a收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器； 经收集透镜b收集后的激光入射至SPM探针的悬臂上，所述SPM探针设于所述样品台的上方；经所述SPM探针反射后的光经所述经收集透镜b收集后入射至SPM探测器，所述SPM探测器输出的电信号输入至SPM信号采集器； 所述SPM探针和样品台均与一位移控制器相连接。
2.根据权利要求
I所述的联用系统，其特征在于所述激光器a输出的所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜。
3.根据权利要求
I或2所述的联用系统，其特征在于所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜a之前经过一反射镜和一滤波片。
4.根据权利要求
I或2所述的联用系统，其特征在于经所述SPM探针反射后的光经所述经收集透镜b收集后再经一半反半透镜后入射至SPM探测器。
5.根据权利要求
1-4中任一所述的联用系统，其特征在于所述SPM探针可为STM探针、AFM探针、TERS金属探针或离子电导探针。
专利摘要
本发明公开了一种超分辨共聚焦光学显微镜与扫描探针显微镜联用系统。激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后入射至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜a收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；经收集透镜b收集后的激光入射至SPM探针的悬臂上，所述SPM探针设于所述样品台的上方；经所述SPM探针反射后的光经所述经收集透镜b收集后入射至SPM探测器，所述SPM探测器输出的电信号输入至SPM信号采集器。由超分辨的光学成像引导SPM成像和分析，由于超分辨的共聚焦光学显微镜分辨率可接近SPM的分辨率，可以实现更高精度的靶点定位。
文档编号G01Q60/02GKCN102809672SQ201210277343
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月6日
发明者方晓红, 袁景和, 于建强, 张雪洁 申请人:中国科学院化学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan