多模式光学高分辨显微镜的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种多模式光学高分辨显微镜，集成了多种先进显微光学成像技术，可以在一台显微系统里同时实现共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED显微成像和STED双光子融合成像，形成一个多功能的高分辨光学显微镜，能够适用于多种研究领域，成为生物医学强有力的研究工具。
【专利说明】多模式光学高分辨显微镜
【技术领域】
[0001]本发明涉及显微物镜光学检测【技术领域】，尤其是涉及一种多模式光学高分辨显微镜。
【背景技术】
[0002]高分辨显微光学成像技术是人们从宏观转向微观，在细胞分子水平实时动态揭示生命的构成和调控机制，获得一系列原创性科学发现，实现生命科学与物理、化学等学科的全面交叉融合的重要手段。
[0003]激光扫描共聚焦显微镜(LaserScanning Confocal Microscopy,LSCM)是一款高分辨光学显微镜，在生物和工业检测领域得到了广泛应用，共聚焦显微镜采用精密针孔滤波技术，使得只有处于焦平面位置上的信息能够被探测，最大限度地抑制了非聚焦平面的杂散光，具有很高的成像分辨率和信噪比；同时系统沿Z轴方向可以实现无损光学断层扫描，从而实现对样本的三维成像。
[0004]双光子显微镜可以看着是在共聚焦显微镜基础上发展起来的一款高端光学显微镜，它利用超短脉冲激光作为激发光源，荧光分子同时吸收两个长波长的光子发射出一个短波长的光子，实现了对深层组织高分辨观察成像，成像深度达到600 μ m左右，克服了共聚焦显微镜观测样本深度浅的缺点。
[0005]受激福射损耗(Stimulated emission depletion, STED)显微镜是在共聚焦显微镜基础上发展起来的超分辨显微镜，它克服了光学衍射极限的限制，分辨率可以达到10-60纳米，远高于共聚焦和双光子显微镜的分辨率。
[0006]STED双光子显微镜结合了 STED显微技术分辨率高和双光子显微技术成像深度深的特点，可以实现对较深组织的超分辨成像。
[0007]以上所列的高分辨显微镜各有优缺点，分别适用于不同的研究领域。这些高分辨显微镜均是从共聚焦显微成像技术发展起来的，如果把这些显微成像技术集成起来，在一台显微镜里可以实现共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED显微成像和STED双光子显微成像，则将形成一个多功能的高分辨光学显微镜，能够适用于多种研究领域，成为生物医学强有力的研究工具。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是:提供一种多模式光学高分辨显微镜，该多模式光学高分辨显微镜能够实现共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED显微成像和STED双光子融合成像，可以适用于多种研究领域。
[0009]本发明的技术方案是:一种光学扫描显微系统，包括第一 STED照明单兀、第二STED照明单元、飞秒激光、合束分束二色镜单元、物镜、三维纳米位移台、荧光成像单元和控制单元；
[0010]所述第一 STED照明单兀包括第一损耗光激光、第一润旋相位片、第一 1/4玻片、第一二色镜和第一激发光激光，所述第一涡旋相位片用于在损耗光激光束中引入0-2位的涡旋相位分布，所述第一 1/4玻片用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光；
[0011]所述第二 STED照明单元包括第二损耗光激光、第二涡旋相位片、第二 1/4玻片、第二二色镜和第二激发光激光，所述第二涡旋相位片用于在损耗光激光束中引入0-2 π位的涡旋相位分布，所述第二 1/4玻片用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光；
[0012]所述合束分束二色镜包括与所述第一 STED照明单元和所述第二 STED照明单元的光路连接的第三二色镜、与所述第一 STED照明单元和所述飞秒激光光路连接的第四二色镜及第五二色镜；
[0013]所述荧光成像单元包括带通滤波片、成像透镜、针孔及光电倍增管；
[0014]所述控制单元与所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光、第二激发光激光、飞秒激光、三维纳米位移台及光电倍增管电性连接，所述控制单元用于控制所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光、第二激发光激光及飞秒激光的开启和关闭、控制所述三维纳米位移台沿X Y Z方向的移动；
[0015]所述控制单元控制关闭所述第一损耗光激光、所述第二损耗光激光和所述飞秒激光并控制开启所述第一激发光激光和/或所述第二激发光激光，所述第一激发光激光出射的光束经所述第一二色镜反射后进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成艾里斑状光斑，所述艾里斑状光斑激发所述样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现共聚焦显微成像；
[0016]所述控制单元控制关闭所述飞秒激光并控制开启所述第一损耗光激光和所述第一激发光激光，所述第一损耗光激光出射的光束经所述第一涡旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色镜进入所述第四二色镜，经所述第四二色镜反射后的光束再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成面包圈状光斑；所述第一激发光激光出射的光束所述第一二色镜反射后进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成艾里斑状光斑；所述艾里斑状光斑和所述面包圈状光斑重叠，以使位于所述艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被所述第一损耗光激光退激发，不再产生荧光，所述艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现STED成像；
[0017]所述控制单元控制关闭所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光和第二激发光激光，并控制开启所述飞秒激光，所述飞秒激光出射的光束依次经所述第四二色镜、第三二色镜及第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦面处形成艾里斑状光斑，所述艾里斑状光斑激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现双光子成像；
[0018]所述控制单元控制关闭所述第一激发光激光、第二损耗光激光和第二激发光激光并控制开启所述飞秒激光和第一损耗光激光，所述第一损耗光激光出射的光束经所述第一涡旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色镜进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成面包圈状光斑；所述飞秒激光出射的光束依次经所述第四二色镜、第三二色镜及第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦面处形成艾里斑状光斑；所述艾里斑状光斑和所述面包圈状光斑重叠，以使位于所述艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被所述第一损耗光激光退激发，不再产生荧光，所述艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现STED双光子融合成像。
[0019]本发明的优点是:
[0020]本发明提供的多模式光学高分辨显微镜，集成了多种先进显微光学成像技术,可以在一台显微系统里同时实现共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED显微成像和STED双光子融合成像，形成一个多功能的高分辨光学显微镜，能够适用于多种研究领域，成为生物医学强有力的研究工具。
[0021]另外，本发明提供的多模式光学高分辨显微镜可以实现两路STED同时成像，可以对样本中的两种荧光成分同时进行超分辨光学成像，扩大了 STED显微成像的适用范围；同时，把双光子成像技术和STED成像技术融合在一起，可以实现对较深组织的光学超分辨成像，将开拓新的生物医学应用领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例提供的多模式光学高分辨显微镜的结构示意图。
[0023]其中:第一 STED照明单元110、第二 STED照明单元120、飞秒激光130、合束分束二色镜单元140、物镜150、三维纳米位移台160、荧光成像单元170、控制单元180、第一损耗光激光111、第一润旋相位片112、第一 1/4玻片113、第一二色镜114、第一激发光激光115、第二损耗光激光121、第二涡旋相位片122、第二 1/4玻片123、第二二色镜124、第二激发光激光125、第三二色镜141、第四二色镜142、第五二色镜143、带通滤波片171、成像透镜172、针孔173、光电倍增管174。【具体实施方式】
[0024]请参考图1，图1为本发明实施例提供的多模式光学高分辨显微镜100的结构示意图。
[0025]多模式光学高分辨显微镜100包括第一 STED照明单元110、第二 STED照明单元120、飞秒激光130、合束分束二色镜单元140、物镜150、三维纳米位移台160、荧光成像单元170和控制单元180。
[0026]第一 STED照明单兀110包括第一损耗光激光111、第一润旋相位片112、第一 1/4玻片113、第一二色镜114和第一激发光激光115,其中,第一润旋相位片112用于在损耗光激光束中引入0-2 π位的涡旋相位分布，第一 1/4玻片113用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光。
[0027]第二 STED照明单元120包括第二损耗光激光121、第二涡旋相位片122、第二 1/4玻片123、第二二色镜124和第二激发光激光125，第二涡旋相位片122用于在损耗光激光束中引入0-2 π位的涡旋相位分布，第二 1/4玻片123用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光。
[0028]合束分束二色镜140包括与第一 STED照明单元110和第二 STED照明单元120的光路连接的第三二色镜141、与第一 STED照明单元110和飞秒激光130光路连接的第四二色镜142及第五二色镜143。
[0029]荧光成像单元170包括带通滤波片171、成像透镜172、针孔173及光电倍增管174。
[0030]控制单兀180与第一损耗光激光111、第一激发光激光115、第二损耗光激光121、第二激发光激光125、飞秒激光130、三维纳米位移台160及光电倍增管174电性连接，控制单兀180用于控制第一损耗光激光111、第一激发光激光115、第二损耗光激光121、第二激发光激光125及飞秒激光130的开启和关闭、及控制三维纳米位移台160沿X Y Z方向的移动。
[0031]控制单兀180控制关闭第一损耗光激光111、第二损耗光激光121和飞秒激光130并控制开启第一激发光激光115和/或第二激发光激光125，第一激发光激光115出射的光束经第一二色镜114反射后进入第四二色镜142，光束经第四二色镜142反射后再分别经第三二色镜141、第五二色镜143透射后进入物镜150，并在物镜150的焦面处形成艾里斑状光斑，艾里斑状光斑激发样本中的荧光物质产生荧光，荧光经物镜150收集后被第五二色镜143反射后进入带通滤波片171，带通滤波片171对荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经成像透镜172后聚焦在针孔173处，透过针孔173的荧光经光电倍增管174收集，光电倍增管174将光信号转变为电信号，电信号被控制单元180采集，控制单元180根据三维纳米位移台160的位置坐标和电信号实现共聚焦显微成像。可以理解，在控制单元180控制第二激发光激光125的开启时，可以实现两路共聚焦显微成像模式。
[0032]控制单元180控制关闭飞秒激光130并控制开启第一损耗光激光111和第一激发光激光115,第一损耗光激光111出射的光束经第一润旋相位片112和第一 1/4玻片113后再透射第一二色镜114进入第四二色镜142，经第四二色镜142反射后的光束再分别经第三二色镜141、第五二色镜143透射后进入物镜150，并在物镜150的焦面处形成面包圈状光斑；第一激发光激光115出射的光束第一二色镜114反射后进入第四二色镜142，光束经第四二色镜142反射后再分别经第三二色镜141、第五二色镜143透射后进入物镜150，并在物镜150的焦面处形成艾里斑状光斑；艾里斑状光斑和面包圈状光斑重叠，以使位于艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被第一损耗光激光111退激发，不再产生荧光，艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，荧光经物镜150收集后被第五二色镜143反射后进入带通滤波片171，带通滤波片171对荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经成像透镜172后聚焦在针孔173处，透过针孔173的荧光经光电倍增管174收集，光电倍增管174将光信号转变为电信号，电信号被控制单元180采集，控制单元180根据三维纳米位移台160的位置坐标和电信号实现STED成像。可以理解，在控制单元180开启第二损耗光激光121和第二激发光激光125,可以实现第二路STED成像；同时开启第一损耗光激光111、第一激发光激光115、第二损耗光激光121和第二激发光激光125，可以实现两路STED同时成像。
[0033]控制单兀180控制关闭第一损耗光激光111、第一激发光激光115、第二损耗光激光121和第二激发光激光125，并控制开启飞秒激光130，飞秒激光130出射的光束依次经第四二色镜142、第三二色镜141及第五二色镜143透射后进入物镜150，并在物镜150焦面处形成艾里斑状光斑，艾里斑状光斑激发样本中的荧光物质产生荧光，荧光经物镜150收集后被第五二色镜143反射后进入带通滤波片171，带通滤波片171对荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经成像透镜172后聚焦在针孔173处，透过针孔173的荧光经光电倍增管174收集，光电倍增管174将光信号转变为电信号，电信号被控制单元180采集，控制单元180根据三维纳米位移台160的位置坐标和电信号实现双光子成像。
[0034]控制单元180控制关闭第一激发光激光115、第二损耗光激光121和第二激发光激光125并控制开启飞秒激光130和第一损耗光激光111，第一损耗光激光111出射的光束经第一涡旋相位片112和第一 1/4玻片113后再透射第一二色镜114进入第四二色镜142，光束经第四二色镜142反射后再分别经第三二色镜141、第五二色镜143透射后进入物镜150，并在物镜150的焦面处形成面包圈状光斑；飞秒激光130出射的光束依次经第四二色镜142、第三二色镜141及第五二色镜143透射后进入物镜150，并在物镜150焦面处形成艾里斑状光斑；艾里斑状光斑和面包圈状光斑重叠，以使位于艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被第一损耗光激光111退激发，不再产生荧光，艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光111退激发的荧光物质产生荧光，荧光经物镜150收集后被第五二色镜143反射后进入带通滤波片171，带通滤波片171对荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经成像透镜172后聚焦在针孔173处，透过针孔173的荧光经光电倍增管174收集，光电倍增管174将光信号转变为电信号，电信号被控制单元180采集，控制单元180根据三维纳米位移台160的位置坐标和电信号实现STED双光子融合成像。
[0035]本发明提供的多模式光学高分辨显微镜100,集成了多种先进显微光学成像技术，可以在一台显微系统里同时实现共聚焦显微成像、双光子显微成像、STED显微成像和STED双光子融合成像，形成一个多功能的高分辨光学显微镜，能够适用于多种研究领域，成为生物医学强有力的研究工具。
[0036]另外，本发明提供的多模式光学高分辨显微镜可以实现两路STED同时成像，可以对样本中的两种荧光成分同时进行超分辨光学成像，扩大了 STED显微成像的适用范围；同时，把双光子成像技术和STED成像技术融合在一起，可以实现对较深组织的光学超分辨成像，将开拓新的生物医学应用领域。
[0037]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【权利要求】
1.一种多模式光学高分辨显微镜，其特征在于，包括第一 STED照明单元、第二 STED照明单元、飞秒激光、合束分束二色镜单元、物镜、三维纳米位移台、荧光成像单元和控制单元; 所述第一 STED照明单元包括第一损耗光激光、第一涡旋相位片、第一 1/4玻片、第一二色镜和第一激发光激光，所述第一涡旋相位片用于在损耗光激光束中引入0-2 π位的涡旋相位分布，所述第一 1/4玻片用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光； 所述第二 STED照明单元包括第二损耗光激光、第二涡旋相位片、第二 1/4玻片、第二二色镜和第二激发光激光，所述第二涡旋相位片用于在损耗光激光束中引入0-2 π位的涡旋相位分布，所述第二 1/4玻片用于将损耗光激光由线偏光转为圆偏光； 所述合束分束二色镜包括与所述第一 STED照明单元和所述第二 STED照明单元的光路连接的第三二色镜、与所述第一 STED照明单元和所述飞秒激光光路连接的第四二色镜及第五二色镜； 所述荧光成像单元包括带通滤波片、成像透镜、针孔及光电倍增管； 所述控制单元与所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光、第二激发光激光、飞秒激光、三维纳米位移台及光电倍增管电性连接，所述控制单元用于控制所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光、第二激发光激光及飞秒激光的开启和关闭及控制所述三维纳米位移台沿X Y Z方向的移动； 所述控制单元控制关闭所述第一损耗光激光、所述第二损耗光激光和所述飞秒激光并控制开启所述第一激发光激光和/或所述第二激发光激光，所述第一激发光激光出射的光束经所述第一二色镜反射后进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成艾里斑状光斑，所述艾里斑状光斑激发所述样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射 后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现共聚焦显微成像； 所述控制单元控制关闭所述飞秒激光并控制开启所述第一损耗光激光和所述第一激发光激光，所述第一损耗光激光出射的光束经所述第一润旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色镜进入所述第四二色镜，经所述第四二色镜反射后的光束再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成面包圈状光斑；所述第一激发光激光出射的光束所述第一二色镜反射后进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成艾里斑状光斑；所述艾里斑状光斑和所述面包圈状光斑重叠，以使位于所述艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被所述第一损耗光激光退激发，不再产生荧光，所述艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现STED成像； 所述控制单元控制关闭所述第一损耗光激光、第一激发光激光、第二损耗光激光和第二激发光激光，并控制开启所述飞秒激光，所述飞秒激光出射的光束依次经所述第四二色镜、第三二色镜及第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦面处形成艾里斑状光斑，所述艾里斑状光斑激发样本中的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现双光子成像； 所述控制单元控制关闭所述第一激发光激光、第二损耗光激光和第二激发光激光并控制开启所述飞秒激光和第一损耗光激光，所述第一损耗光激光出射的光束经所述第一涡旋相位片和所述第一 1/4玻片后再透射所述第一二色镜进入所述第四二色镜，所述光束经所述第四二色镜反射后再分别经所述第三二色镜、第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜的焦面处形成面包圈状光斑；所述飞秒激光出射的光束依次经所述第四二色镜、第三二色镜及第五二色镜透射后进入所述物镜，并在所述物镜焦面处形成艾里斑状光斑；所述艾里斑状光斑和所述面包圈状光斑重叠，以使位于所述艾里斑状光斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子，被所述第一损耗光激光退激发，不再产生荧光，所述艾里斑状光斑中央区域未被所述第一损耗光激光退激发的荧光物质产生荧光，所述荧光经所述物镜收集后被所述第五二色镜反射后进入所述带通滤波片，所述带通滤波片对所述荧光中残留的激光进行截止，同时透射荧光，透射出的荧光经所述成像透镜后聚焦在所述针孔处，透过所述针孔的荧光经所述光电倍增管收集，所述光电倍增管将光信号转变为电信号，所述电信号被所述控制单元采集，所述控制 单元根据所述三维纳米位移台的位置坐标和所述电信号实现STED双光子融合成像。
【文档编号】G02B21/00GK103676123SQ201310697916
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】张运海, 姜琛昱 申请人:中国科学院苏州生物医学工程技术研究所