专利名称：对激素及相关材料的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及称为鱼促性腺素释放激素(pGnRH)及有时称为鱼促黄体生成素释放激素(pLHRH)之鱼激素的延伸类似物。具体地说，本发明涉及在天然pGnRH氨基酸序列的C末端加上一个包括半胱氨酸或酪氨酸残基的短氨基酸序列所形成的pGnRH的类似物，其在溶液中的构象基本上无改变的情况下，使其多肽结合物适于生产抗pGnRH抗体，本发明还涉及免疫鱼的方法。
商品鱼养殖业是在世界各地迅速发展的工业。西欧、北美和南美、加拿大和东海岸都是鱼类，特别是大麻哈鱼主要生产地。例如，美国在1989年生产了185，000吨大麻哈鱼，紧接其后的是鲇鱼市场。另一方面，作为西欧大西洋大麻哈鱼主要生产国的挪威，1989至1990年的产量为120，000吨。据估算，到本世纪末，世界大麻哈鱼市场平均每年增长7.5%，每年营业额为20亿英磅。虽然目前欧洲是海洋鳊鱼和鲈鱼的主要生产地区，且在东欧和非洲已在养殖鲤鱼，但也设想对海洋鲈鱼和大鲮鲆，以及较长时期内对拟庸鲽鱼和鳕鱼的商业开发。
在水产养殖中，特别需要控制鱼的性成熟，以便阻止体细胞生长转向生殖腺生长、降低鱼的质量、以及表现出商业上不期望的第二性征。特别是对于鲑科鱼类，早熟幼鲑和未成熟幼鲑可因在幼鲑未达到产品大小时中止生产而带来严重的经济影响，以及因为在短时期内急于收获幼鲑而降低其市场价值。此外，在鱼由养殖场游走并贡献于天然基因库的情况下，期望抑制已养殖鱼的繁殖力。
从逻辑上看，问题是与收获性成熟的鱼相关联的。这些不能出售，并且总是有一定比例的有早成熟优势的雄性鱼常在其他鱼之前成熟。而从未成熟鱼中分离出性成熟的鱼要花费时间和经费，一旦鱼开始成熟，它们或多或少都要经过同样的时间和速度，从而给收获造成困难。因此，找到一种同时控制鱼成熟的方法无疑是有宜的。
例如，由于早熟，致使常常不能达到收获鱼的理想重量，即被迫在不太适宜的时期收获，而控制成熟则将能避免错过量适收获时期并可使鱼长到理想的大小。
迄今为止，确保不致于发生性成熟的最有效办法是养殖不育鱼。尽管进行了大量的实验研究，但仍没有就显示两态性的群体实现这一目的。
已有几种方法用于控制鱼的性成熟，如包括手术去雄、三倍体化和性控制(后两种方法是属遗传学技术)。过去曾尝试了用外科方法使鱼去雄，但终因它们带来很大花费以及在进行这种程序后造成鱼的损伤而放弃了。
三倍体方法是一种在鱼个体内造成三组染色体存在的方法，用以诱导三倍体雄性和雌性鱼的不育。然而存在几个与三倍体有关的缺点。首先，这是一种需要长时间才能完成的麻烦费时的方法。为使三倍体的卵存活，须进行高质量的处理过程，虽然所得到的鱼看来都是活的，但这一存活率包括了15-20%的平均损失量，同时在产卵季节以外三倍体鱼的生长速率要比二倍体鱼慢。在接近产卵期时，雄性和雌性三倍体之间有很大差异，其中雄性发育可接近正常检验标准及所有相关第二特征，而雌性三倍体则没有发育明显的卵巢，且在正常产卵时表现出未成熟的外观。
成功地应用诱导的三倍体要求合用唯雌性技术(female-only technique)，而这在商业上是不合算的。与三倍体有关的其他的缺点是，它们与二倍体在同一池内竞争而导致生长不好，而且三倍体雌性鱼的生长并没有显示出超过成熟二倍体雌性鱼。
鱼是高度二态的，即它们可在雄性和雌性间互变，并可以控制性别的改变。对于养殖目的，如从生长速度的观点看，一种性别通常是更可取的。大菱鲆和鳗鲡便是雌性比雄性生长得更大的例子。在幼鲑中，幼年雄性和雌性鱼有差不多同样的生长速度，但后来雄性鱼发育了不期望有的特征。在成熟期，雄性停止生长，渐渐褐色并变得爱寻衅，其作为食品和玩物的价值就很差。另外，饲养的硬头鳟和大西洋大麻哈鱼的成熟雄性，一旦放入海水培养池中，便不能够适应于盐水而导致死亡。可应用一种产生性别倒转，以得到所有雌性群体的方法，但它包括了向鱼饲料中掺入激素，使得鱼不适于作为餐桌上的食品，其他控制鱼能育性的方法如光照、化学绝育和给予激素也都不可靠，不经济或不适用于生产作为食品的鱼。
控制性成熟的免疫学方法已在哺乳动物身上取得某些成功。然而，对哺乳动物激素和免疫学反应的研究并不能成为研究鱼生理学的坚实基础。鱼是冷血动物，而且它们的免疫系统可在不同条件下有所变异。温度即对鱼的免疫反应具有显著影响，以致在生理范围内有较高温度时即表现较高的免疫反应水平。生理上的低温度可延迟抗体产生的速率并可抑制免疫记忆的建立，对此T淋巴细胞似乎特别敏感。
此外，鱼的免疫系统受到可能合理变动之激素的影响。激素水平可因搬运和抓捕等压力或水质量如氧含量低等的影响而改变。在小鲑鱼由河入海和性成熟期(为两个基本的激素改变时期)，鱼由于体内淋巴细胞数目减少而对疾病尤为敏感。
再者，鱼只产生一种类型的抗体分子，即IgM，而已确定哺乳动物体内有五大类抗体。
还有就是鱼的内分泌系统实质上不同于哺乳动物的内分泌系统，例如由鲑科鱼如大麻哈鱼和南乳鱼产生的鱼促性腺素释放具有下列序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-Gly-NH2(Sherwood et al，1983;“Characterisation of a teleost GnRH”，PNAS USA802794-2798)，其第7和8位上的氨基酸不同于哺乳动物LHRH。
我们现已发现，可将一类鱼GnRH的类似物连接到适当的载体分子上并用于免疫鱼，如此即可诱导产生抗交叉反应性免疫原的抗体，后者对GnRH有高亲和力并可中和内源性GnRH。
根据本发明的一个方面，我们提供了有下列氨基酸序列的鱼GnRH的类似物pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z其中W代表Gly或一个D-氨基酸X代表一个键，或一个或多个相同或不同的氨基酸，Y代表Cys或Tyr或没有Y，且Z不存在或代表1个或多个相同或不同的氨基酸，或1个连续或不连续的肽链，各间断处存在非α氨基酸多功能接头部分或反向转换氨基酸，条件是当W是Gly，X和Y不存在时，存在Z。
位置W处的残基最好是Gly，其为天然存在的残基;位置Y处的残基最好是Cys，因为它常常更特异，且比以C末端Tyr得到者更易于接到载体蛋白上。
X最好代表相对小数目的残基，如1至15个，较好是1至8个，更好是1至3个，最好是只有一个。虽然X位上可以存在任何一个或多个氨基酸，但这个氨基酸残基最好是Gly。当然，其他氨基酸，较好是有小侧链的氨基酸如Ala、Ser、Asn和Val也可以存在于X位上，且这个位置上的任何氨基酸残基均包括在本发明的范围内。还应该注意的是，X位上可包括一个以上的相同或不同的残基，例如在下列序列中pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Ala-Y-Z。
应明确的是，X位上没有氨基酸残基的pGnRH也包括在本发明的范围内。
在根据本发明之pGnRH的优选实例中，Z位上没有氨基酸残基，且根据本发明的类似物之特别优选的实例具有下列序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys。
然而，我们的研究显示，Z位上包括附加氨基酸时一般对分子其余部分的构象选择并没有明显影响。如果Z位包括了这样一个延伸，那么在本发明的优选方案中，此延伸将包括能作为T细胞抗原决定基之蛋白序列的一个或多个小片段。例如，通式1-2-3-4之氨基酸序列的小片段，其中1是Gly或带电荷的氨基酸(如Lys、His、Arg、Asp或Glu)，2是疏水氨基酸(如Ile、Leu、Val、Met、Tyr、Phe、Trp、Ala)，3是疏水氨基酸(如上限定的)或不带电荷的极性氨基酸(如Asn、Ser、Thr、Pro、Gln、Gly)，且4是极性氨基酸(如Lys、Arg、His、Glu、Asp、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro)，至少在某些例子中似乎可作为T细胞抗原决定基(Rothbard，J.B.& Taylor，W.R，(1988)，A sequence pattern in common to T-cell epitopes，The EMBO Journal7(1)93-100)。相似的小片段可以是序列1′-2′-3′-4′-5′，其中1′相当于上面限定的1，2′相当2，3′和4′相当于3，5′相当于4(出处同上)。两种形式均包括于下面限定的通式中pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-S-T-S′，其中T代表含有一个或多个T细胞抗原决定基的肽序列小片段(最好少于5个氨基酸)，其可以是上一段中限定的类型或者是其他结构的，且可被有任何长度或组成的间隔基小片段分隔开，而S和S′(其中每个可适当地和单独地被删去)则代表有任何长度和组成之氨基酸序列的间隔基小片段。S的长度最好少于5个氨基酸残基，并包含例如选自Gly、Ala、Pro、Asn、Thr、Ser或多功能接头如非α氨基酸的残基。S′最好少于10个氨基酸残基且可包含如非α氨基酸这样的多功能接头;S′部分最好从上面给出的S代表的氨基酸中得出。有可能S′代表一完整蛋白质，因此便不一定要连接到载体蛋白上。
应注意的是，当Z不存在时，可以在X位置上提供上面提到的T细胞抗原决定基。
基本类似物的衍生物也包括于本发明范围内，其中Z是或包括“反向倒转”氨基酸。即具有相当于某氨基酸之官能团的双官能胺。例如一个根据本发明并包含反向倒转氨基酸的类似物可具有下列通式
其中R是任何官能团，更好是Gly，A1和A2各自更好是由其C末端连接的本文限定之类似物之一的拷贝(但不一定是相同的)。在特别优选的实施方案中，A1或A2之一中Y位置上的Tyr或Cys应被另一拷贝之相应位置之上残基以外的任何类型的氨基酸所取代，或者其可被删去。因此该二聚体的连接是通过Y位上残基之一(也可以是两残基)的侧链实现的。另外，A1和/或A2可以是天然pGnRH的，且反向倒转氨基酸的R可以是Cys或Tyr。如前面所讨论的，T细胞抗原决定基也可以被包括在小片段Z中。
类似物可具有下列通式
其中B是反向倒转氨基酸，A1和A2是相同或不同的，且具有下示序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z′
其中W、X和Y的定义同上，Z′与前述的Z相同。只是它不包括反向倒转氨基酸。
对肽的反向倒转修饰包括倒转一个或多个肽键以产生比原始分子对酶降解有更大抗性的类似物，并为产生分支免疫原提供了一种方便的途径，对于中等到大的免疫原来说，该分支免疫原将含有高浓度的抗原决定基。在短链生物学活性肽之反向倒转类似物的大批量溶液合成中，使用这些化合物具有很大的潜在价值。
本发明的另一方面提供了制造具有下列氨基酸序列之鱼GnRH类似物的方法pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z，其中W代表Gly或D-氨基酸，X代表一个键，或一个或多个相同或不同的氨基酸，Y代表Cys或Tyr，或不存在，且Z不存在，或代表一个或多个相同或不同的氨基酸，或连续或不连续的肽链，各间断处存在非α氨基酸多官能接头部分或反向倒转氨基酸，条件是当W为Gly，且X和Y不存在时，存在Z，该方法包括使用已知的化学、生物学和/或重组技术偶联各残基并分离该类似物。
可使用标准的肽合成技术，如Merrifield于1963年(J.Am.Chem，Soc.85，2149)介绍的固相肽合成法(SPPS)合成本发明的类似物。该方法中，生长的肽链通过其C末端共价连接到不溶性固相载体上。通过在预期序列中连续加入氨基酸进行合成。在这种情况下，所有纯化的中间步骤(这些步骤对于溶液中合成是必不可少的)均简化为简单的冲洗，因为大多数反应的降解作用的付产物都被溶在了反应混合物中。SPPS的优点是迅速、相对容易完成而且是一种可以部分或全部自动化的方法，使用SPPS有可能产生出几十克的肽。
简单地说，1963年由Merrifield发展的SPPS包括下述四个阶段(A)通过在整个合成过程中均保持稳定的共价键，将第一个被保护的氨基酸连接到固相载体上;
(B)在任何侧链官能团的保护基团均稳定的条件下，通过去保护而重新产生被连接之残基的游离氨基酸基团;
(C)通过缩合形成酰胺键，使下一个被保护的氨基酸与第一个氨基酸偶联。重复步骤B和C，直到合成过程完成;
(D)在合成完成时，由固相载体上释放出肽并除去任何的氨基酸侧链保护基团。
文献中已描述了许许多多氨基酸保护基团的组合，但目前常用的只有其中两种组合。第一种是叔丁氧基碳酰(Boc)/苄基组合物，其从1963年就已由Merriifield使用，而且至今仍被广泛采用。最近已令人惊奇地发现，由Sheppard等人发展的芴基甲氧基碳酰(Fmoc)/叔丁基系统也得到了广泛的应用(Sheppard，R.C，1986，Science Tools，The LKB Instrument Journal33，9)。进一步的例子包括由Arsady，R.等人建立的使用固相树脂的Fmoc-聚酰胺方法(J.Chem，Soc.Perkin Trans，1981，1，529-537)，用芴基甲氧基碳酰(Fmoc)保护被掺入的个别氨基酸(Atherton，E.et al，J.Chem，Soc.Perkin Trans，1983，1，65-73)及9-芴基甲氧基碳酰(Fmoc)化学法(如参见Atherton，E.et al，1985，J.Chem.Soc.Chem，Comm，165)。
此外，通过遗传密码编码本文所述各肽类似物之序列的DNA和RNA分子也包括在本发明范围内。可在适当的微生物或真核细胞培养物表达系统中使用这些DNA分子，用以产生本文所述的类似物。已在这样的系统中合成了相似分子并已在本文献中述及(如参见欧洲专利申请85307311.2号)。
应注意的是，不能使用这样的系统直接制得掺入反向倒转氨基酸衍生物的类似物。但可以进一步纯化基本类似物并使用标准的肽/有机化学方法将其连接到反向倒转氨基酸上。最近已描述了在聚酰胺型树脂上固相合成反向倒转肽的实用而且方便的新方法[Gazerro，H，Pinori，M.&Verdini，A.S.(1990)，A new general Procedure for the solid-phase synthesis of retro-inverso peptides，In“Innovation and Perspective in Solid Phase Synthesis”Ed.Roger Epton.SPC(UK)Ltd.Birmingham，UK]。
最好将类似物连接到载体分子上，以得到类似物结合物。任何小分子或大分子载体或微生物都可以使用，但优选的是下列常用的载体钥孔 血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡γ球蛋白(CGG)、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DPT)、纯化的结核菌素蛋白微生物(PPD)、胞壁酰二肽(MDP)、大豆胰蛋白酶抑制物(STT)及霍乱毒素或其B亚单位。值得注意的是，在使用PPD的情况下，用BCG疫苗引发更为有利(Lachmann，P.et al，1986，In“Synthetic Peptides as Antigens”，Ciba Foundation Symposium119，pp.25-40)。
作为自家免疫接种鱼时所用LHRH类似物的载体，特别优选的是下列作为疫苗成分的微生物或大分子抗原杀鲑气单胞菌(Aeromonas salm onici da)(疖疡病)、Yersinia ruckeri(ERM)和鳗弧菌(Vibrio anguillarium)与Vibrio ordalii(弧菌病)的混合物。
最近，已试验了下列五个基本类型疫苗的抗疖疡病效果(后者是由革兰氏阴性非游动菌杀鲑气单胞菌引起的)整个被杀死或破坏的细胞(菌苗)，细胞外产物(ECP)和ECP类毒素，整个被杀死的细胞ECP合用，活减毒疫苗及纯化的抗原。此外，也已将在鱼和哺乳动物体内产生的抗某些抗原的超免疫血清用于被动保护。另外，已成功地生产出了抗大口水牛鱼肠炎(enteric redmouth ERM)(该病是由革兰氏阴性游动细菌Yersinia rukeri引起的)的疫苗(或菌苗)，其包含福尔马林灭活的全细菌培养物。最近在北半球国家使用的商品弧菌病疫苗包含最常见菌种鳗弧菌和V.ordalii的混合物。这些疫苗是含有全细胞和ECP之混合物的简单灭活的培养物。
本发明的再一个方面，提供了含有根据本发明之pGnRH类似物或类似物结合物以及兽药用赋形剂的疫苗。
这些疫苗可用于自家免疫鱼，且本发明的再一方面是提供一种抑制鱼性发育的方法，该方法包括给所说的鱼使用有效量的pGnRH类似物或类似物结合物，以使所产生的抗pGnRH抗体滴度足以显著降低内源性pGnRH的生物学效能。
可使用文献中已充分描述的试剂和方法，很容易地制得Y位上含有Cys或Tyr之类似物的结合物。例如，可使用N-γ-顺丁烯二酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺(Calbiochem)，通过硫酯键将Y位上含有Cys残基的鱼GnRH类似物连接到载体蛋白质的赖氨酸侧链上，同时可与N-(4-重氮苯基)-顺丁烯二酰亚胺形成连接Y位置含Tyr残基之类似物的重氮键。
可使用本领域已知的方法很容易将肽和结合物纯化到必要的程度，这些方法如包括高效液相层析，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及快速液相层析。
本发明的肽-载体结合物可用于下列目的(1)免疫任何动物，以产生用于下面所述特定需要的抗鱼GnRH抗体
(2)对鱼进行抗鱼GnRH的自家免疫，以便-减慢、停止或消退性发育-控制、限制或消除生殖力-治疗GnRH依赖性鱼肿瘤-进行鱼生理学/兽医学研究;
(3)用作检测如血清样品中是否存在抗鱼GnRH抗体的诊断试剂。
针对类似物的抗鱼GnRH抗体也构成本发明的一部分。例如它们可以1)用作研究鱼生理学/免疫学的研究工具2)作为产生抗同种异型抗体的免疫原;
3)进行被动免疫，以便-实现在短期内减慢、停止或消退性发育-达到短期内控制生殖力-治疗GnRH依赖性鱼肿瘤-另外干扰鱼GnRH的活性。
(可通过给予在鱼或哺乳动物体内产生的多克隆、单克隆或单一区域抗体进行被动免疫)4)作为检测例如血清样品内是否存在鱼GnRH的诊断剂。
很显然，上面2)中提到的抗同种异型抗体也构成本发明的一部分。
可按照常规方法制备能与本发明的合成多肽特异结合的多克隆或单克隆抗体、这些抗体的嵌合形式或鱼类特有的形式(如参见Morrison et al，(1984)PNAS(USA)81，6851-6855;Riech-mann et al，(1988)Nature 332，323-327)，及单一区域抗体(如参见Ward，E.S，Gussow，D.Griffiths，A.D.，Jones，P.and Winter，G.(1989)Nature 341，544-546)。如上所述，这些抗体也被认为是本发明的一部分。
在检测抗鱼GnRH抗体或鱼GnRH方面，本领域技术人员可使用各种已知的免疫检测技术，如可使用竞争或竞争性抑制检测法或直接和间接标记法。一种优选的检测抗鱼GnRH抗体的药盒包括了本发明的类似物或类似物结合物、标记工具及固相载体。相似地，一种检测鱼GnRH的药盒包含了可与本发明之类似物特异结合的抗体或抗原结合片段、标记工具及固相载体。
可经几种方法使用鱼疫苗，如注射、经口服途径及通过浸没等。
腹控内注射是疫苗接种的最有效方法，同时便于使用可提高免疫反应程度的佐剂。缺点是鱼需要麻醉的相应处理，这样就会使鱼经受压力并且加大劳动强度。但如果使用重复利用的注射器和生产线系统，每小时可以注射1000条鱼。不过这不适于小于15克的鱼。
口服疫苗接种适合于对大批量各种大小的鱼给药，而且没有因操作造成的压力。缺点是需要使用大量的疫苗，从而提高了成本，而且不好控制每条鱼的使用剂量。口服疫苗效力差，导致保护作用的水平低而且不恒定，大多数口服给药都是针对弧菌病疫苗的。
优选的直接浸没法(D.I)是一种简单而快速的方法，只需要与疫苗接触几秒钟。这种方法现已实现了自动化并已针对弧菌病和ERM疫苗建立了“浴”和“水洗”变换的操作程序，且只简单地包括将疫苗倒入存贮罐中。虽然这种方法要消耗更多的疫苗并需要较长的接触时间(约一小时，包括水的氧合作用及密切监测鱼受到的压力)，但其劳动强度比注射法要小。
用含有(Ⅰ)与一种以上类型载体分子结合的已知类似物，和/或(Ⅱ)一种以上与同样载体分子结合之类似物的混合疫苗浸没可能更为有利。此外，可将任何肽类似物，它们的结合物及其混合物加在任何适当的佐剂或释放系统中使用，并且可将一种以上的佐剂和释放系统合在一起，形成所谓“超级混合物”。优选的佐剂和释放系统包括氢氧化铝(明矾)、微球体、脂质体、胶束、核糖体、ISCOMS、Brauns脂蛋白及全细胞或微生物鱼疫苗成分。
下面借助非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1使用标准固相Fmoc方法合成本发明的pGnRH的羧基端延伸形式。在三氟乙酸存在下由树脂上裂解肽，然后用凝胶过滤、离子交换层析及反向高效液相层析法进行纯化。借助MBS(m-顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺苯酯)将肽连接到各种载体上。
已证明鸡γ球蛋白(CGG)对于硬头鳟鱼的其他疫苗是一种很好的载体，并被用于本实施例中。还使用了PPD，因为这是一种已在哺乳动物的实验研究中被证实的载体(尽管在免疫前需要用BCG)。
以肽∶蛋白质为30-40∶1的摩尔比例，将pGnRH类似物偶联到载体上，并以三个不同的浓度给硬头鳟作腹腔内注射。
然而使用棘根过氧化物酶(HRP)连接的单克隆抗鳟鱼免疫球蛋白以酶联免疫法(ELISA)监测血清抗体反应，每周测一次共10周。在本实施例的某些试验中，用载体预免疫或使用佐剂，或进行加强注射。以确定产生抗pGnRH抗体的最佳免疫程序。
实施例2按实施例1中确定的最佳免疫程序免疫一组待成熟的硬头鳟鱼。用实施例1中所述方法监测抗体反应，同时监测生长速度及性类固醇(如睾酮)的产生。实验结束时将鱼杀死，除去性腺并称重，以确定性腺体指数(GSI)。然后固定性腺，以便用光学显微镜进行组织学研究。免疫过的鱼比未处理的对照组鱼有明显好的GSI。
实施例3用偶联到结核菌素纯化之蛋白质衍生物上的鲑鱼性腺素释放激素延伸类似物(sGnRHa-PPD)免疫成熟的硬头鳟。
方法
a)将sGnRH-Gly-Cys连接到PPD上在苯甲酰化纤维素管中使结核菌素PPD(1.008mg/ml+苯酚防腐剂，Evans Limited)对0.9%NaCl于12℃下透析过液，以除去苯酚。然后用聚乙二醇(pG20000)处理1.5小时，将PPD浓缩到4.032mg/ml。在室温下使PPD溶液(2.5ml，含10.08mg PPD在5.04ul二甲基甲酰胺(DMF)中与1.08mgN-γ-顺丁烯二酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺(GMBS)混合1小时，然后上Sephadex G-25M PD-10柱，并用3.5ml缓冲液A(0.05M NaH2PO4、0.14M NaCl，pH7.0)洗脱。将溶解在蒸馏水中的4.687ml浓度为3mg/ml的sGnRH-Gly-Cys及缓冲液A(即，14，0616mg SGnRH-Gly-Cys逐滴地加到PPD中。在氮气环境下将溶液室温混合2小时，并自始至终估测游离硫羟含量。在苯甲酰化纤维素管中使结合物对蒸馏水12℃透析过液，然后储存于-20℃下备用。
b)游离硫羟分析使用试剂5，5′一二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNS)及还原态谷胱甘肽标准品估测结合物的游离硫羟含量。使用按比例缩小的Ell-man氏测定法的微量滴定板变体，其中向50μl样品中加入2μl10mMDTNB和250μl PBS(pH8)，10分钟后在405nm处测定吸光率。
C)硬头鳟鱼和免疫程序使用各种组合的冷冻打印工具分别标记130条成熟硬头鳟(长度约30cm)。记录每条鱼的长度和重量并取600μl血样测定预免疫血清抗体水平。另外，检测血清类固醇水平，以确定鱼的性别。将鱼分成两组，分别予以加在弗氏完全佐剂(FCA)内的sGnRH-Gly-Cys-PPD或盐水作腹腔内注射。再将处理组和对照组分别分出雄性和雌性。雄性鱼放在光线和温度条件下。雌性再进一步分成两组一组放在环境光线和温度条件下(温度可在14℃或较低温度间变动)，另一组则置于环境光线和14℃条件下。用后一组鱼估计温度对抗sGnRH-Gly-Cys抗体滴度的影响及在鱼成熟中造成的任何差异。整个实验中，以四周间隔对各条打印记的鱼进行称重检测和放血。用ELISA法检测血清中的抗sGnRH-Gly-Cys抗体(使用sGnRH-Gly-Cys-BSA)，并使用RIA法检测类固醇激素17-β-雌二醇和/或11-酮睾甾酮(11-ketotestosterone)。
d)类固醇分析用放射免疫法检测成熟鱼血清中17-β-雌二醇(E2)和11-酮睾甾酮(11-KT)的浓度。该项分析中，使放射活性标记的类固醇结合到有限量的类固醇特异性抗体上，这一相互作用可因加入未标记的类固醇而部分地受到抑制。
e)抗sGnRH-Gly-Cys ELISA分析的最佳化将结合到牛血清白蛋白(BSA)上的鲑鱼类GnRH-Gly-Cys用于ELISA分析法。将加在0.5ml缓冲液A中的10mgBSA与加在5μlDMF中的1mgGMBS合并，最后偶联到6.246mgsGnRH-Gly-Cys上。ELISA方格盘检测法可以在成熟实验中选择适于进行抗sGnRH-Gly-CysELISA分析的sGnRH-Gly-Cys-BSA包被浓度。
结果ⅰ)抗sGnRH-Gly-Cys抗体滴度如表1所示(雄性和雌性)在用sGnRH-Gly-Cys-PPD免疫(2μg sGnRH-Gly-Cys/鱼，加在FCA中腹腔内注射)后8周，相对于对照组增加了抗sGnRH-Gly-Cys抗体滴度。
ⅱ)硬头鳟成熟期间血清17-β雌二醇的水平用sGnRH-Gly-Cys-PPD免疫的影响如表2中所示，直到免疫后4周，处理组和对照组成熟雌性鳟鱼的血清17-β雌二醇水平以同样速度增加。到免疫后第8周，对照组的17-β雌二醇水平仍以同样速度继续增加。但在免疫后8周，成熟雌鱼中的sGnRH-Gly-Cys-PPD组则比对照组成熟雌鱼具有低得多的17-β雌二醇水平(P<0.05t试验)。
ⅲ)抗体滴度和类固醇水平间的相互关系很显然，用sGnRH-Gly-Cys-PPD免疫后，抗体滴度的增加是与成熟硬头鳟血清17-β-雌二醇水平的少量增加相互关联的，数据表明，pGnRH-Gly-Cys-PPD在延迟雌性硬头鳟性成熟中是积极有效的。
权利要求
1.制造有下列氨基酸序列之鱼GnRH类似物的方法pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z其中W代表Gly或D-氨基酸，X代表一个键，或一个或多个相同或不同的氨基酸，Y代表Cys或Tyr或不存在，且Z不存在或代表一个或多个可以相同或不同的氨基酸，或连续或不连续的肽链，各间断处存在非α氨基酸多官能接头部分或反向倒转氨基酸，条件是当W是Gly，X和Y没有时，Z存在，该方法包括使用已知的化学、生物学和/或重组技术偶联各残基并分离该类似物。
2.根据权利要求1的方法，其中W是Gly。
3.根据权利要求1或2的方法，其中Y是Cys。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中X是一个或多个甘氨基酸残基。
5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中X或Z包含至少一个T细胞抗原决定基。
6.根据前述权利要求中之任一项的方法，其中Z包含反向倒转氨基酸。
7.根据权利要求6的方法，其中类似物具有下列通式A1-B-A2其中B是反向倒转氨基酸，A1和A2是相同或不同的，且具有下列序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z′其中W、X和Y如权利要求1中限定的，Z′同权利要求1中限定的Z，但它不包括反向倒转氨基酸。
8.根据权利要求1的方法，其中类似物具有序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys。
9.根据前述权利要求中之任一项的方法，其包括将类似物连接到载体分子上。
10.制造疫苗的方法，其中将权利要求1至8中任一项所限定的类似物或权利要求9中限定的类似物结合物与兽药用赋形剂混合。
11.检测样品中抗鱼GnRH抗体的药盒，所说的药盒包含上述权利要求1至8之任一项中限定的类似物，或权利要求9中限定的类似物结合物、标记工具及固相载体。
12.使用权利要求1至9之任一项中限定的类似物制备减缓、停止或消退鱼性发育或控制鱼生殖力的药物。
13.根据权利要求1至5中之任一项或权利要求8的方法，其中类似物是以重组技术作为连续肽链产生的。
14.制造特异地结合权利要求1至7中之任一项限定的类似物之抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括用权利要求1至8中之任一项限定的类似物或权利要求9限定的类似物结合物免疫被免疫对象，并分离所形成的抗体或产生抗体的细胞。
15.检测样品中鱼GnRH的药盒，所说的药盒包含权利要求14中限定的抗体或抗原结合片段、标记工具和固相载体。
16.如权利要求15中限定的抗体或抗原结合片段用于制造减缓、停止或消退鱼的性发育或控制鱼生殖力的药物。
17.制造对权利要求14中限定的抗体或抗原结合片段特异之抗同种异型抗体的方法，该方法包括用按照权利要求14所述的方法产生的抗体或抗原结合片段免疫被免疫对象并分离所形成的抗体。
18.对鱼进行抗鱼GnRH免疫，以减缓、停止或消退性发育，或控制、限制或消除生殖力的方法，该方法包括给鱼投予有效量权利要求1至8中之任一项限定的类似物或权利要求9限定的类似物结合物或权利要求14限定的抗体或抗原结合片段。
19.根据权利要求18的方法，其中鱼被浸没在含有权利要求1至8中之任一项限定的类似物或权利要求9限定的类似物结合物或权利要求14限定的抗体或抗原结合片段的水中。
20.根据权利要求18的方法，其中权利要求1至8中任一项所限定的类似物或权利要求9限定的类似物结合物或权利要求15限定的抗体或抗原结合片段是经口服给予的。
全文摘要
本发明公开了制造鱼GnRH类似物的方法，所说的类似物具有下列序列pGlu—His—Trp—Ser—Tyr—W—Trp—Leu—Arg—Pro—Gly-X-Y-Z其中W，X，Y，Z的定义见说明书。可将类似物连接到载体上并用以例如延迟发动性成熟及提高生长率。
文档编号G01N33/74GK1063109SQ9210014
公开日1992年7月29日 申请日期1992年1月9日 优先权日1991年1月9日
发明者R·V·菲什雷利, B·罗布桑 申请人:普罗托斯分子设计有限公司