专利名称：对虾白斑杆状病毒快速检测方法
技术领域：
本发明涉及我国对虾爆发性流行病原—白斑杆状病毒(C型杆状病毒)的快速检测方法，该方法适用于对虾(包括虾苗及虾各组织)和虾养殖环境中水生生物等的检疫，检测或诊断。
本发明是根据所测得的部分对虾白斑杆状病毒DNA的序列，利用PCR(聚合酶链式反应)技术检测对虾白斑杆状病毒。关于对虾白斑杆状病毒的PCR检测，台湾大学的罗初芳等在《水产生物疾病》(DIS·AQUAT·ORG，Vo1.25,1996)杂志上发表了PCR法检测该病毒，所用引物对PCR扩增后的带为1447bP(碱基对)大小，扩增带大，灵敏度低。另外，上海生化所周国瑛和黄海水产所郭福生等在《1996年第二届全国人工养殖对虾疾病综合防治和环境管理学术研讨会论文集》上分别发表相关文章周国瑛等提出的方法所用样品量大(5g)，提取方法繁杂，操作不便，此外引物对的序列未公开；郭福生等的论文中所用引物对是参照草虾包含体杆状病毒(A型杆状病毒)的多角体基因序列设计，因而特异性差。
对虾白斑杆状病毒，至今没有建立细胞系，所以材料受限制。其属于C型杆状病毒，无包含体，分离过程中病毒易降解，所以其基因组的DNA序列在国内外未见报导，也未有相关专利。本发明是在获得完整病毒基因组，将部分酶切片段克隆并经地高辛标记作为探针进行DNA斑点杂交，选择虾病毒DNA杂交信号强，而正常虾染色体无杂交信号的克隆片段进行序列测定。依据所得的序列设计并寻找特异性强、灵敏度高的引物对用于PCR，达到快速、准确、灵敏地检测。
PCR方法常受模板DNA样品的纯净影响，本发明利用盐酸胍的强变性作用，并辅以TritonX-100一类的温和去污剂来解聚组织细胞的蛋白，最后用玻璃粉Sillca(2.1mm)吸附一定大小的DNA片断，去除PCR的抑制因子，使PCR反应很好地进行。
酶切克隆片断的DNA序列测得如下LOCUSPWSBV1 1421 bp DNA1 GAATTCAGCA GAATTGTTTC CTTCTTAACC ATTCTTCGTA AGAACATTAC ACCCGCATTA61 GTCGACCCTA AAGGCGCGTT ACACGAGAAA GTAGCCATCT ATTTGACCCT TCTTTCAACC121 AAATCAAAAC TAGAAAACTT TTTCCAATAC GGTCTCAGTA ATTCGTCCTC AGTTGATCTT181 AGCCATCTAA AACCCATTAA TTGTAGCAAC AATCTCAAGA ATATTGAAGA CACATTCATG241 TACAGAAAGT CCACCCTATT CTTATTATGG CCCTCCCAGA AAATTTCACA GCTCTCTTGC301 AACAGGAACA AATGGACCCC GATACTGCCA TTGAAAGCAG ACGCTCCCTT ACCACCTTCC361 TTATCATTCC AACACTGCTT CAATGGCGAA CGGTGCAAGA GCCGCTGTGG GTGCAGGAGG421 AGGAAACCCA ATGGGCTTGT ATCTTTTTTC CCACATTCTT CACGAGTCTA CCGTCACAAC481 ATCAAACCCC GTCACAGACA CCACAGAAAA CGTCAACTAT ATTCCTCTGT TACCAGATCC541 TGTTATGGTA GTGAACCCCT TCAAGGATTC TGCTAGGTTG ATCGTTAACA ACAACAATTC601 TGGAATTGAT GTCTTGAATG ATAAGTCGTG CAACTACTTG CAAGTATCCA TGCCATCTGA661 ATCATCTGGC CTCGTCACCA ATACTGGATG CTCTTCTTCT TCTTCCTCAT CTTCGTCTGA721 TACCTTCAAG TACGTCAGGA GAGACAATAC GCCTGTGAAT CTTCCCCGTG TCACACCAGC781 CGTTCTCTGT TCTGATGCTT CCTCTAATCT CTTGGACGTG TTCTCCAGGG CAGATATTGT841 CCTCGAAAAC ATGAACGTGA GATTTGGTTT CATGCCCGAG ATTATTGCTG CCGTCTCCAA901 ATTCAAGGGG CTGACCAAGG AAGAGGTTAT TAAGCAAATG GTTTCTCAGA ACAACATCAA961 CAACAACAGC AACAACAACA ACGGAAATGG GAAGAAAACA ACCGTCGATC CAGTCACTGG1021 GGATATTGTT ATCACCAATG CCACATTCCC CGACACTCGT CCTCTATACA CTGCAGCAAA1081 TGGAGGAACA TCATCATTCA AATGGGGAGA TATCAACGAC AGAAAAATGC ACGCCAAGGC1141 TTTCCCCACC TTCTTTATTG GTAACCCAAC CGCCGCCGCA ACAGCTAACG GAGTGCCTCT1201 TACATCTGAG GGAATTTCCC TCACTGAAGA AAAACGCAAG AAAATCGCAG GCATCTCTGA1261 AGGATCAATT GGCACGGGGG CTCTGCGTGC AGCGGCCAAC ACCCGCCTCT CATCCGACAT1321 GGAACCTGTC ATGAAGGGAT GGAACAACAT TGTTCAGCTT CAACAAACAT TCAAGAAAGC1381 TTCAGATAAA CTCACTCATC TTTTGAGATC GGGAGGAATT C
PCR引物对序列如下N端引物tac tgc cat tga aag cag acg ctcC端引物tta ata acc tct tcc ttg gtc agcPCR的模板DNA样品制备方法如下盐酸胍裂解液(配方见后)裂解匀浆组织，低速离心去除杂质，Silica纯化。
以下对本发明的方法进行详细描述实验对象怀疑带有该病毒的新鲜对虾或其冷冻品；实验材料所用试剂为普通试剂，可向生物试剂公司购买。
裂解液6M盐酸胍溶于TE缓冲液中，含1％TritonX-100，调PH7.4；TE缓冲液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH 8.3；洗涤液等体积混合乙醇和TEM缓冲液TEN缓冲液20mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，PH7.4；实验步骤1.从实验对象摘取内脏(诸如肝胰腺、肠、或腮等)。
2.取上述样品(如是虾苗或肌肉，则取0.3g)于装有500ul裂解液的1.5ml小离心管中，用合适的玻棒匀浆器匀浆15min，10,000rpm离心5min；3.转移上清液，加入3ul Silica(2.1mm)，冰水浴中放置30min，不时的振荡；14,000rpm离心15sec，弃上清，沉淀用洗涤液洗，反复2次；最后加入15ulTE缓冲液，充分混匀，55℃热水浴5min，高速离心30sec，取上清得到模板DNA样品。
4.按标准50ulPCR反应体系加入DNA样品5ul，95℃变性5min后，照下列文件94℃，45sec；60℃，45sec；72℃，1min扩增40个循环。
5.取PCR产物10ul，在1.5％琼脂糖胶电泳，EB(溴乙锭)染色，紫外检测，扩增片断大小为611bp(碱基对)。
本发明公开的DNA序列经过DNA斑点杂交证明与对虾染色体无同源性，根据序列设计的PCR引物对具有很强的特异性，结合PCR技术的快速、灵敏，近3～4小时即可完成全过程，使对虾杆状病毒的检测准确、快速。本发明将为对虾白斑杆状病毒的检疫、快速诊断、流行病学等方面提供强有力的技术手段。
权利要求
1.一种检测对虾白斑杆状病毒的方法，其特征在于所用PCR引物依据纯化后的病毒DNA酶切片断克隆的序列设计。
2.一种如权利要求1所述的检测对虾白斑杆状病毒的方法，其特征在于病毒DNA酶切片断克隆的序列为LOCUSPWSBV1 1421 bp DNA1 GAATTCAGCA GAATTGTTTC CTTCTTAACC ATTCTTCGTA AGAACATTAC ACCCGCATTA61 GTCGACCCTA AAGGCGCGTT ACACGAGAAA GTAGCCATCT ATTTGACCCT TCTTTCAACC121 AAATCAAAAC TAGAAAACTT TTTCCAATAC GGTCTCAGTA ATTCGTCCTC AGTTGATCTT181 AGCCATCTAA AACCCATTAA TTGTAGCAAC AATGTCAAGA ATATTGAAGA CACATTCATG241 TACAGAAAGT CCACCCTATT CTTATTATGG CCCTCCCAGA AAATTTCACA GCTCTCTTGC301 AACAGGAACA AATGGACCCC GATACTGCCA TTGAAAGCAG ACGCTCCCTT ACCACCTTCC361 TTATCATTCC AACACTGCTT CAATGGCGAA CGGTGCAAGA GCCGCTGTGG GTGCAGGAGG421 AGGAAACCCA ATGGGCTTGT ATCTTTTTTC CCACATTCTT CACGAGTCTA CCGTCACAAC481 ATCAAACCCC GTCACAGACA CCACAGAAAA CGTCAACTAT ATTCCTCTGT TACCAGATCC541 TGTTATGGTA GTGAACCCCT TCAAGGATTC TGCTAGGTTG ATCGTTAACA ACAACAATTC601 TGGAATTGAT GTCTTGAATG ATAAGTCGTG CAACTACTTG CAAGTATCCA TGCCATCTGA661 ATCATCTGGC CTCGTCACCA ATACTGGATG CTCTTCTTCT TCTTCCTCAT CTTCGTCTGA721 TACCTTCAAG TACGTCAGGA GAGACAATAC GCCTGTGAAT CTTCCCCGTG TCACACCAGC781 CGTTCTCTGT TCTGATGCTT CCTCTAATCT CTTGGACGTG TTCTCCAGGG CAGATATTGT841 CCTCGAAAAC ATGAACGTGA GATTTGGTTT CATGCCCGAG ATTATTGCTG CCGTCTCCAA901 ATTCAAGGGG CTGACCAAGG AAGAGGTTAT TAAGCAAATG GTTTCTCAGA ACAACATCAA961 CAACAACAGC AACAACAACA ACGGAAATGG GAAGAAAACA ACCGTCGATC CAGTCACTGG1021 GGATATTGTT ATCACCAATG CCACATTCCC CGACACTCGT CCTCTATACA CTGCAGCAAA1081 TGGAGGAACA TCATCATTCA AATGGGGAGA TATCAACGAC AGAAAAATGC ACGCCAAGGC1141 TTTCCCCACC TTCTTTATTG GTAACCCAAC CGCCGCCGCA ACAGCTAACG GAGTGCCTCT1201 TACATCTGAC GGAATTTCCC TCACTGAAGA AAAACGCAAG AAAATCGCAG GCATCTCTGA1261 AGGATCAATT GGCACGGGGG CTCTGCGTGC AGCCGCCAAC ACCCGCCTCT CATCCGACAT1321 GGAACCTGTC ATGAAGGGAT GGAACAACAT TGTTCAGCTT CAACAAACAT TCAAGAAAGC1381 TTCAGATAAA CTCACTCATC TTTTGAGATC GGGAGGAATT C
3.一种如权利要求1所述的检测对虾白斑杆状病毒的方法，其特征在于PCR引对序列为N端引物tac tgc cat tga aag cag acg ctcC端引物tta ata acc tct tcc ttg gtc agc
4.一种如权利要求1所述的检测对虾白斑杆状病毒的方法，其特征在于对模板DNA样品的提取方法是将盐酸胍强变性剂与温和去污剂、Silica一类纯化物有效地结合。
全文摘要
本发明是在获得纯化的对虾白斑杆状病毒DNA的基础上,酶切片断克隆测序为依据,设计PCR引物对,应用PCR技术来检测对虾是否罹患该病毒,从而达到早诊断,早预防,早治疗;并且可对该病的流行病学进行研究。用快速方法从对虾组织中提取模板DNA样品,去除PCR抑制因子,使得PCR方法得以实行,真正做到快速、灵敏、特异。
文档编号G01N33/569GK1199859SQ97112049
公开日1998年11月25日 申请日期1997年5月20日 优先权日1997年5月20日
发明者王玮, 杨丰, 陈荣忠, 徐洵 申请人:国家海洋局第三海洋研究所