专利名称：检测艾滋病毒的光谱方法
技术领域：
本发明是关于光谱技术方法用于检测病毒，特别是检测艾滋病毒。
艾滋病病毒(HIV)是一种引起人体免疫缺损的病毒，艾滋病是目前威协人类生命和健康的首要疾病。据文献报道，1988年全世界艾滋病患者在25万以上，而受HIV感染的人多达5百万；1992年美国可能有36万艾滋病例。亚洲虽是艾滋病的低发区，但是截止到1992年已有200万人已经感染了艾滋病。有些国家和地区，由于人口密度大，经济文化比较落后，医疗水平低下，艾滋病患者和感染者有快速增加的趋势。目前，艾滋病人诊断和治疗，均极端困难，医疗费用极高。据统计，1981-1991年间，全世界为诊治艾滋病所付出费用高达2400亿美元。
人类免疫缺损病毒，主要是通过性接触、接触血液和血制品以及在产期中的母亲对婴儿的传染。全世界每年因输血造成艾滋病感染的悲剧令人震惊。
艾滋病毒，曾经于1983年首次被提取分离出来，此后于1985年在西非洲水中又鉴定出了第二种艾滋病毒。这两种病毒分别被叫做HIV1和HIV2，它们呈现出相似的生物学和形态特性，它们的整体结构是相同的，都是由RNA，蛋白质，碳水化合物和脂类4个部份组成(见附图6)，但却具有遗传和抗原的差别，图6是用电子显微术和其它方法对艾滋病毒复杂结构的解剖结构，球状外壳中呈截头圆锥形的核心部分是最主要的结构特征。
艾滋病的诊断防治(包括血制品的检验)及抗艾滋病毒药物研制都需要有效的检验方法。经文献检索表明，从1985年到1995年间，检测艾滋病毒的方法专利有234件，但都属于生物化学和分子生物学方法。例如免疫试验、抗原-抗体、单克隆抗体、核酸杂交、细胞融合等方法。也有用Raman光谱法成功研究其它病毒的报道，例如1976年美国麻省理工学院Thomas等人在“J.Mol.Biol.”上发表文章谈到用Raman光谱研究MS2-Phage(噬菌体)的结果，但至今尚无光谱法用于检测艾滋病毒的报道。然而，目前用来检测艾滋病毒的生物化学方法和分子生物学方法，本身还存在许多缺点方法较复杂、技术难度大、准确性有问题、检测时间周期长、需用较多血样、易造成污染等。
本发明的目的是针对目前检验艾滋病毒技术方法中存在的缺点和问题，寻求、提供一种能直接测定含有艾滋病毒的血清、血液、精液、和唾液的物理方法，且其灵敏度高、专一性强、准确性高、快速简便。
本发明基于多年的基础研究经验提供了一种检测艾滋病毒的光谱方法，利用该方法和技术能够直接、快速和准确地检测出艾滋病毒。本发明的技术内容如下1、仪器和样品准备本发明用于检测艾滋病毒的光谱仪主要为激光拉曼(Raman)光谱仪，也包括Raman微探针、FT(傅里叶转换)-Raman光谱仪以及红外光谱仪和FT-红外光谱仪。测定样品前，校正仪器使处于良好可用状态，取液体被检测样品；如果被测样品为干细胞或固体，可按仪器说明书要求制备试样，以备检测之用。利用光谱法测定艾滋病毒的技术，无需特殊训练和要求，一般光谱分析人员即可进行。样品检测后的谱图，与对照样品(标准艾滋病毒纯样品)的图谱比较，普通人肉眼即可辨别，是否存在艾滋病毒。
2、样品检测法将液体被检物10～15μL用注射器注入石英管和或硬质玻璃管(1～3mm直径)，将管子置于谱仪的样品台上，开动仪器进行测定。激光功率从200mW-800mW；激发线波长从紫外，可见到红外均可，功率也随之而变。重点检验(1)450～1750cm-1,(2)2500～2600cm-1,(3)2800～3100cm-1。光谱分辨率2-4cm-1(可以再外延1～2cm-1)，累加次数(信号平均)，步长和积分时间随样品的特点及所用的谱仪等条件而定，以达最佳信噪比为宜。如果被测样品为细胞或固体，可按仪器说明书要求制样，再用Raman微探针测出。
3．图谱处理(1)先做出无艾滋病毒感染的血清的Raman谱图；(2)再做出有艾滋病毒感染的血清的Raman光谱图，从(1)和(2)对比可知艾滋病毒的特征Raman频率，本发明已测得了HIV1和HIV2的特征Raman频率(所用的样品请看实施例)；(3)将同样条件下测得的未知体液的Raman光谱的特征Raman频率与(2)中提供的艾滋病毒的特征Raman频率进行比较，对照，可以迅速而准确地判定。
下面将结合附图对本发明作进一步说明
图1是阴性人血清的拉曼光谱(A)和人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱(B)，用作比较选择的有关光谱区域为450至3100cm-1。实验条件是激发线波长514.5nm，功率500mW，三单色器的四个狭缝宽度分别为700,800,800,700μm，光谱分辨率4cm-1，步长1cm,积分时间和信号平均分别为0.1和7次扫描(在450-1750cm-1),0.2和5次扫描(在2500-2600cm-1),0.2和2次扫描(2800-3100cm-1)，室温18±2℃。
本发明的检测实验，所用艾滋病毒是由美国V-TECH公司提供；仪器是使用法国Jobbing Yvon公司的JY-T800型Raman光谱仪；采用美国的NIC 1180小型计算机(配有专门做拉曼光谱的程序)；激光器是美国Spectra Physics公司生产的164型氩离子激光器。
图1至图5是对图1拉曼光谱的不同光谱区域给予更加详细的展示。
图2是阴性人血清的拉曼光谱图(450-1750cm-1)，实验条件与图1相同。
图3是人血清中HIV1和HIV2的光谱图(450-1100cm-1)，实验条件与图1相同。
图4．人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱图(1100-1750cm-1)，实验条件与图1相同。
图5．A、阴性人血清和B、人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱图(2800-3100cm-1)，实验条件与图1相同。
本发明首次报道了人血清中艾滋病毒(HIV1和HIV2)与对照样品阴性人血清的拉曼光谱图，实际上将成为艾滋病毒的一套标准拉曼光谱图，可供科研，医疗卫生、血制品、血库等方面作为参比标准使用，只需比较谱图各特征峰即可确知有无艾滋病毒。这种方法在体外能够快速、准确地检测出体液中(血液、精液、唾液等)及各种血制品等物中的艾滋病毒。
上述光谱检测法的实验过程和科学上的理论分析(谱图特征峰与艾滋病毒空间结构间关系)如下本发明所提供的人血清中艾滋病毒的拉曼光谱图是首次得到的真实的RNA-蛋白质-碳水化合物-脂类复合物的拉曼光谱图，是艾滋病毒空间结构的信息。
从图1可清楚地看出，拉曼信号主要是产生于HIV1和HIV2的上述四种主要组分的谱图，即这些突出的谱线和特征峰是产生自艾滋病毒的糖蛋白的碳水化合物、蛋白质、RNA及脂类。
人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱，是碳水化合物产生的拉曼散射起着支配作用。在碳水化合物的异头C1位上有β构型。二股病毒RNA的骨架估计是A型构象。病毒蛋白质的二级结构保持有α螺旋、β-折叠、β-回折和无规卷曲的结构。病毒的脂双层处于凝胶相。在18℃下所测得的人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱谱线(450-3100cm-1)，详见表1所示。
表1．在18℃所测得的人血清中HIV1-HIV2的拉曼光谱(450-3100cm-1)频率(cm-1) 病毒的四种组成碳水化合物 RNA 蛋白质 脂类465493Man503skeletal modes r S-S str51 GlcNac S-S str521 S-S str537GlcNac S-S str548 Trp581C,G Trp596C602Man613620 Phe631GlcNac r640 Trp669Man G676684692703GlcNac C-S str717 C-S strC-N sym728A736GlcNac743Man Ⅱe,Asn751C759 Trp,Val769Man778786 C,U Thr814 P Asn832Man Tyr,Val851 Tyr859880β-configuration C-C str,TrpMan Val907Man C-C str926COH C-C str933GlcNac C-C str952Man C-C str
表1．(续)频率(cm-1) 病毒的四种组成碳水化合物 RNA 蛋白质 脂类974 Man r994 CH2rock1004 rPhe1048 Cl-H bendingrC-N strC-O,C-C,GlcNac1089 COH C-N strC-C str1106 Man P1123 Man,GlcNac C,U C-N str1132 Man C-N strC-C str1157 r C-N str11721178 G,A,CTyr11931205 Tyr,Phe1226 A AmideⅢ1237 U,C AmideⅢ1244 AmideⅢ1250 A,C AmideⅢ1264 AmideⅢ1277 CH2OH,Man AnideⅢ1282 Man,GlcNac,COH AmideⅢ1303 A,C AmideⅢ1322 GlcNac GC-H def1330 C(6)-H2,CH3COH1341 AC-H def,Trp1348 COH bending,Man1356 Trp1365 GlcNac GC-H def1379 CH3,GlcNac,G,U,AMan1394 C-H bending1408 Man CO2sym str1419 G,A1433 GlcNac Trp(N-H def)1456 CH2hcnding CH2bending CH2bending1484G,A1494 Man1508A15201527C1537 ManG1555 GlcNac AmidcⅡ,Trp1581G,A Trp1567
表1．(续)频率(cm-1) 病毒的四种组成碳水化合物 RNA 蛋白质 脂类16131620Man C=O str,UTrp,Tyr,Phe16281635GlcNac(AmideⅠ)1644 AmideⅠ1660CO str, AmideⅠU,G,C1669 AmideⅠ1681C=O,str AmideⅠU,G,C16961725 C=O str1740 C=O str2552 S-H str,Cys2578 S-H str,Cys2853 CH2sym str2883 C-H str CH2asym str2900C-Hstr,Man2935C-H str,Man C-H str C-H str CH3sym str2979C-H str,Man C-H str C-H str缩写词说明标准3-字符号是用于各氨基酸和碳水化合物；一字符号是用于RNA碱；r=ribose，核糖；p=磷酸酯；Man=D-Mannose，甘露糖；GlcNac=N-乙酰基-D-葡萄糖胺。其中已知有一些特殊类型的振动模式，它们由以下缩写词表示sym=对称，str=伸缩，def=-形变，A=腺嘧啶，U=尿嘧啶，G=鸟嘧啶，C=胞嘧啶，Trp=色氨酸，Tyr=酪氨酸，Phe=苯丙氨酸。
1、阴性人血清的拉曼光谱图说明阴性人血清的拉曼光谱的一些谱线主要是属于蛋白质(参见图2)。这此些谱线是分别出现于500,521,543cm-1(S-S Str),744cm-1,(C-S,Str),832,852cm-1(Tyr),1003cm-1(Phe),2554cm-1(S-Hstr),1070,1081,1124cm-1(C-N str),1342cm-1(C-H def),1459cm-1(CH2弯曲),2935,2978cm-1(C-H Str)。主链酰胺Ⅲ和酰胺Ⅰ的谱线是分别出现于1226,1232cm-1(β-折叠)，1299cm-1(α-螺旋)，1253cm-1(无规卷曲)以及1655CM-1(α-螺旋)，1668CM-1(β-折叠或无规卷曲)。有趣的是，似乎阴性人血清的蛋白质光谱中没有来自β-回折和色氨酸的信号。此外，在阴性人血清的拉曼谱图中也没有来自脂类，碳水化合物和RNA的信号。
2、人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱图解释相比之下，人血清中HIV1和HIV2的拉曼光谱的突出的拉曼谱线是产生于病毒糖蛋白的碳水化合物，蛋白质(包括各种酶)，RNA和脂双层。这四种组份的谱线有时是独立的，有时又被此重叠。
(1)人血清中HIV1和HIV2的碳水化合物的拉曼光谱重量占包膜糖蛋白的50％的是碳水化合物，属于HIV1和HIV2的碳水化合物的一些强谱线出现于880,1048,1089,1277,1348及1456cm-1.在880cm-1的谱线是属于异头C1位上的β-构型。甘露糖和N-乙酰糖胺是GP120寡糖的主要成分，其强谱线出现于493,880,1048,1272,1350,1450,1466cm-1。 N-乙酰-O-糖胺的强谱线出现于515,537,1048,631,736,1282,1322,1330,1379及1635cm-1。
(2)人血清中HIV1和HIV2的蛋白质的拉曼光谱这些病毒的蛋白质包括基质蛋白、蛋白外壳，核外壳、蛋白酶、反转转录酶、整合酶与核糖核酸酶等。此外，还有病毒的多肽。
主链构象HIV病毒蛋白的主链酰胺Ⅲ的谱线出现于1237,1226cm-1(β-折叠)，1264,1277,1282cm-1(α-螺旋)，1303cm-1(β-回折)及1244,1250cm-1(无规卷曲)。蛋白质的主链酰胺Ⅰ的谱线，出现于1644和1681cm-1(β-回折)，1660cm-1(α-螺旋或无规卷曲)及1669cm-1(β-折叠或无规卷曲)。C-N伸缩振动出现于1048,1089,1123,1132,1157cm-1。CH2弯曲出现于1456cm-1和C-H伸缩振动在2883,2935及2979cm-1等谱线，都是很清楚和很强的。
侧链构象属于侧链的谱线是产生于芳香残基，出现于548,581,759,880,1341,1356,1433,1555,1581及1620cm-1(色氨酸的吲哚环)，640,832,851,1178,1205，及1620cm-1(酪氨酸的P-羟基苯环)，620,1004,1205及1620cm-1)(苯丙氨酸的单取代苯环)。色氨酸在1356cm-1的谱线也很清楚。此外，还有胱氨酸，蛋氨酸等的S-S键、在503、515、521及537cm-1的伸缩振动及半胱氨酸的-SH基在2552,2578cm-1的谱线；天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基出现于1725,1740cm-1和1408cm-1。
(3)人血清中HIV1和HIV2的RNA的拉曼光谱这主要是主链磷酸二酯，磷酸离子，4个碱基A.G.C.U和核糖的空间结构。主链磷酸二酯(PO2)在814cm-1的对称伸缩振动谱线是明显的，它表明该病毒的双股RNA呈A型构象，在1106cm-1的对称伸缩属于磷酸离子。病毒RNA中的核糖C-O和C-C伸缩振动是出现在974,1004,1048及1157cm-1，核糖骨架变形谱线出现于503和631cm-1。此外，还有碱基的许多的谱线。
(4)人血清中HIV1和HIV2的脂类的曼光谱病毒的脂类所产生的谱线出现于717,1089,1132,1456,2853,2883及2935cm-1。这些谱线分别属于胆碱的C-N对称伸缩，C-C主链振动，CH2弯曲振动及C-H伸缩振动。
(5)结论将人血清HIV1和HIV2的拉曼光谱图(A)与阴性人血清的拉曼光谱图(B)进行比较可以看出在B中的强的特征谱线880,1048,1089,1277,1348,1456,1644,1660,2883,2935,以及2979cm-1，是十分明显地表明着它们双方的差别。
本发明的效果利用光谱法检测艾滋病毒具有很高的准确性，因为Raman和红外光谱图都具有“指纹”鉴定的特征。美国和法国的Raman光谱仪的波数精度高达±0.1CM-1，分辨率高达0.28cm-1(检收指标)，因而该图谱有很高的重现性。
本发明检测艾滋病的光谱方法，与主述生化及分子生物学方法相比，具有下列优点(1)能直接测定含有艾滋病毒(例如HIV1,HIV2)的血清和血液、唾液、精液等，且所需样品量少，每次只需15-20μL即可；(2)灵敏度高能够直接和同时测得艾滋病毒的四种组成RNA、蛋白质、糖和脂类)及它们的空间结构的信息；(3)专一性极强和准确性极高有无艾滋病毒的血液或血清呈现出的信息(谱图)完全不同；(4)快速简便检测一个样品大约需要0.5-3小时(视谱仪的检测器类型而定)。对初中毕业生经短期培训操作规程即可进行检测，对照标准样品图谱即可判定血液或血清中是否有艾滋病毒；(5)安全无污染对测试人员及环境无污染；(6)设备投资的效益高建立检测装置，购买进口激光拉曼光谱仪需要费用约10-15万美元，但可连续使用30-40年，作为艾滋病检测中心长远考虑是合算的。(其间只需调换消耗性器材如激光管等)。
实施例1被检测的样品是阴性人血清(未被HIV感染)和强阳性人血清(含有HIV1和HIV2),HIV即人类免疫缺损病毒。它们均来自美国V-TECH公司(地址在Pomona,CA,91767,U.S.A)。(见“说明书”)样品注入1.0mm内径的石英管内。
用法国的Jobing Yvon公司的JY-T800 Raman光谱仪进行测定。用美国的NIC1180小型计算机(配有专门做Raman光谱的程序)控制及数据处理。激光器是美国Spectra-Physics公司生产的164型氩离子激光器，激发线波长514.5nm，功率500mW，光谱分辨4cm-1，三单色器的4个狭缝宽度700,800,800,700μm，步长1cm-1，积分时间和信号平均0.1和7次扫描(在450-175cm-1),0.2和5次扫描(2500-2600cm-1),0.2和2次扫描(2800-3100cm-1)，室温18°±2℃。获得HIV1和HIV2的Raman光谱和特征Raman频率与指定表(450-1750cm-1,2500-2600cm-1,2800-3100cm-1)见附图1-5和表1。对照，比较阴性人血清与含HIV1和HIV2的人血清，便可确知艾滋病毒存在。实施例2实验方法同实施例1，不同之处在于使用红外光谱，结果也得到同样的谱图和特征谱线。
权利要求
1.一种检测病毒的光谱方法，其特征在于对艾滋病毒的检测，包括(1)检测前的准备，即调整光谱仪器，将液体被检物注入直径为1-3mm的石英管或硬质玻璃管中，置于仪器的样品台上，(2)样品测定，包括对a．无艾滋病毒感染的(阴性)血清和b．有艾滋病毒感染的(阳性)血清，进行光谱检测，重点检测450-1750cm-1,2500-2600cm-1和2800-3100cm-1，得到附图1-5的一系列谱图，及表1中列示的一系列谱线，(3)图谱处理从a与b两种谱图对比，可确知艾滋病毒的特征拉曼频率(拉曼谱线)，(4)未知体液的艾滋病毒鉴定将同样条件下测得的未知体液的拉曼光谱的特征拉曼频率(谱线)与b．提供的艾滋病毒的特征拉曼频率(谱线)进行比较对照，便可迅速准确地判断未知体中是否有艾滋病毒。
2.如权利要求1所述的检测艾滋病毒的光谱方法，其特征在于得到的有艾滋病毒的拉曼光谱，包括在880,1048,1089,1272,1348,1456,1644,1660cm-1及2578,2883,2935和2978cm-1的强谱线和属于HIV1和HIV2的4个组份的全部特征Raman频率。
3.如权利要求1所述的检测病毒的光谱方法，其特征在于所使用的光谱仪器包括激光拉曼光谱仪、拉曼微探针、傅里叶转换拉曼光谱仪、红外光谱仪及傅里叶转换红外光谱仪(带光纤和探头)。
4.如权利要求1所述的检测病毒的光谱方法，其特征在于所说的液体被检物包括体液、血液、血清、精液和唾液及各种血制品。
全文摘要
本发明提供了一种检测体外液体被检物中是否存在艾滋病毒的拉曼光谱方法,重点是检测450—3100cm
文档编号G01N21/25GK1210259SQ9711685
公开日1999年3月10日 申请日期1997年9月2日 优先权日1997年9月2日
发明者许以明 申请人:中国科学院生物物理研究所