专利名称：测定饮料的喷涌因子的方法
技术领域：
本发明涉及一种如权利要求1的前序部分中定义的测定饮料的喷涌因子的方法。
在啤酒生产中，如果应用霉菌感染的大麦酿造啤酒，生产的啤酒就可能喷涌。喷涌是啤酒的一种过度冒泡现象，例如，当开瓶时啤酒可能涌出酒瓶。引起喷涌的最恶劣因子是镰孢属(Fusarium)霉菌，但还在链格孢属(Altenaria)、曲霉属(Aspergillus)、黑孢属(Nigrospora)、青霉属(Penicillum)和葡柄霉属(Stemphylium)的霉菌中观察到喷涌活性。对霉菌产生的喷涌因子的研究已进行了数十年，但迄今还不能准确地鉴定和表征那些因子。现已确定了，喷涌因子是肽或者至少是含肽的化合物。此外，已发现它们呈疏水性和酸性。大多数霉菌的喷涌因子都极富含半胱氨酸(cystein)。最近研究说明了喷涌因子集结于大麦壳中这一假定的理由。
目前，啤酒的喷涌倾向是通过测定一批大麦中被镰孢属霉菌感染的谷物比例而测试的。如果受感染的谷物比例超过允许限度，就舍弃该批。该方法既费力又操作得慢，而且不是定量的。该方法最差的缺点是，不能应用它测定引起喷涌的真实因子(喷涌因子)。所以，结果可能导致不正确的结论。
本发明的目的是消除上述缺点。
本发明的一个特定目的是公开一种从饮料的原料测定饮料(尤其是啤酒)喷涌倾向的可靠方法，一种在质量控制中适用的方法。具体地说，本方法的目的是从谷物测定啤酒中的真实喷涌因子的量。
本发明方法的特征如权利要求1中所述。
本发明基于为了研究引起啤酒喷涌的因子而进行的研究工作，在此期间，确定了疏水性蛋白质(疏水蛋白)是啤酒的喷涌因子。
疏水蛋白是霉菌产生的小疏水性蛋白质，一般包含例如100±25个氨基酸。迄今，已从数种霉菌真菌和食用蘑菇分离了疏水蛋白。疏水蛋白的一个特征在于，它们具有8个位于相应于某式的蛋白质中的半胱氨酸残基。疏水蛋白出现在霉菌菌丝体和孢子的表面以及培养基中的分泌物中。疏水蛋白是促进菌丝体(mycocelia)与培养基连接和彼此连接的作用剂，并且，它们在气生菌丝体和孢子的表面形成保护层，保护它们以免浸透水。已确定了，疏水蛋白聚集在相之间的界面(例如培养液中的气泡表面)，在界面上形成两亲膜。由于它们的成膜能力，疏水蛋白把物质的表面性质从疏水性改变成亲水性，反之亦然。它们减小水溶液的表面张力的能力可与某些合成洗涤剂的相比。疏水蛋白被描述于例如下列文献中Wessels,J.G.H.,“疏水蛋白改变真菌表面的性质的蛋白质，”微生物生理学进展(Advances in MicrobialPhysiology),vol.38,1997,Academic Press Limited,PP.1～45以及Wessels,J.G.H.,“真菌疏水蛋白在界面起作用的蛋白质，”植物科学动向(Trends in Plant Science),vol. 1,s.9～15。疏水蛋白稳定气泡，引起培养液起泡沫。已确定了，现在从霉菌分离的疏水蛋白引起啤酒的喷涌。
按本发明，饮料的原料中和/或饮料中[尤其是谷物(例如大麦)、麦芽和/或啤酒]中疏水蛋白的量可通过适用于测定疏水蛋白的任意方法测定。
在一个优选的实施方案中，疏水蛋白是通过应用疏水蛋白抗原与抗体之间的免疫反应而免疫法测定的。该免疫法可以是免疫放射法、免疫酶法、免疫荧光法或免疫光度法。测定中需要的对疏水蛋白蛋白质呈特异性的抗体是通过生产抗体的常规方法生产的。
疏水蛋白蛋白质可从具有喷涌活性的霉菌菌株分离，尤其从镰孢属菌株分离。适用的菌株例如有Gibberella avenacea[燕麦镰孢(F.avenaceum)]、大刀镰孢(F.culmorum)、早熟禾镰孢(F.poae)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)[禾本科镰孢(F.graminearum)]、黑孢菌(Nigrospora sp.)和T.reesei。疏水蛋白可通过常规方法(例如通过提取、鼓泡和/或低温干燥法)从霉菌菌丝体和/或培养液分离。
疏水蛋白可通过三相提取法从菌丝体分离和/或通过对溶液鼓泡(引起产生的泡沫中的疏水蛋白浓缩)从培养液分离，和/或通过将培养液深度冷冻，引起疏水蛋白沉降，接着通过将溶解后的溶液离心而分离。
在测定疏水蛋白的方法的一个优选的实施方案中，应用了ELISA(酶联免疫吸附测定法)。该方法的酶反应中产生的颜色或荧光指示疏水蛋白的存在和量。ELISA法，抗体的制备和纯化以及其中应用的酶、结合物和底物被描述于例如下列文献中Vaag,P.,“饮料工业中的酶联免疫吸附测定法(ELISA)原理和实践，非酒精饮料的分析”[现代工业分析方法，新系列vol.8(Modern Methods of PlantAnalysis,new series vol.8)],Liskens,H.H.和Jackson,J.F.编辑,Springer-Verlag,Berlin 1988,pp.1～29。
在本发明的方法中，还可应用其它相应的免疫操作，例如EBStrALISA(酶生物素链霉亲和素联动免疫吸附测定)法。该EBStrALISA法被描述于例如下列文献中Vaag,P.,“大麦和麦芽中镰孢属的免疫检测”，欧洲酿造协会会报，里斯本(Proc.Eur.Brew.Conv.Lisben),1991,pp.553～560。
在本方法第二个优选的实施方案中，应用基于免疫层析的试验条免疫层析法测定了疏水蛋白。本方法中免疫反应产生的颜色指示疏水蛋白的存在和量。
应用的试验条可包括例如具有活动标记粒子的层析膜和两个静态疏水蛋白抗体区。样品被吸收入试验条膜中，它在那里与标记粒子反应，然后漂移入膜上的抗体区。如果样品含有疏水蛋白，抗体区中将会由于免疫反应而出现有色试验线条和对比线条。如果样品不含任何疏水蛋白，将会只出现对比线条。
当需要测定谷物中的主要喷涌因子时，本发明使得有可能用一种新颖可靠的准确方法替代基于镰孢属真菌的指标的半定量检测法(如工业质量控制中应用的方法)。通过选择应用的谷物(尤其是大麦)，通过该新方法，将可能减少对于已被证实是费钱而效率低的预防措施(尤其在谷物质量低、因而从谷物生产的啤酒表现强烈喷涌倾向的危险年代中)的需要。
此外，所述新的免疫检测法为测定大麦的喷涌倾向提供了一种更迅速、更简便因而更廉价的方法。
在下文中，将通过几个实施例详细描述本发明。
实施例1．疏水蛋白的分离和说明从下列具有喷涌活性的霉菌菌株分离了疏水蛋白Gibberellaavenacea(燕麦镰孢)(VTT-D-80141)、大刀镰孢(VTT-D-80148)、早熟禾镰孢(VTT-D-82182)、玉蜀黍赤霉(禾本科镰孢)(VTT-D-95470)、黑孢菌(VTT-D-79122)和T.reesei(VTT-D-74075)。
在如下三种不同的底物上培养霉菌在琼脂上、在培养液中和在大麦中。疏水蛋白是通过三相提取法和通过对培养液鼓泡而分离的。通过凝胶电泳确定了含于样品中的蛋白质的分子分布。由T.reesei菌株产生的疏水蛋白大小约为7.5kDa。由黑孢菌(菌丝体提取)菌株产生的和由早熟禾镰孢(对培养液鼓泡)菌株产生的疏水蛋白大小大致相同。从玉蜀黍赤霉菌株的菌丝体提取的疏水蛋白大小约为20kDa。
为了说明样品中的疏水蛋白，应用了免疫ELISA试验。采用下列免疫方案制备了该试验中应用的抗体。应用由T.reesei霉菌产生的疏水蛋白(将它与弗氏佐剂混合)将兔免疫接种。在三个月期间注射4次，通过应用ELISA法测定血液的抗体含量两次而监测效价发展(titredevelopment)。在免疫期结束时，采集兔血液并从血液分离血清。通过测定在ELISA法中仍给出响应的最稀血清稀释度而测试血清的反应性。稀释度大于1/100 000。
在试验中，将疏水蛋白样品吸移入微量滴定板的孔中，结果是样品中的蛋白质附着在孔壁上。然后添加疏水蛋白抗体，它识别出壁上的疏水蛋白蛋白质并与它连接。此后，添加结合物，它又与抗体连接。所述结合物包含一种酶，该酶使被吸移入孔中的底物着色。底物的色度与样品中的疏水蛋白含量成正比。
从早熟禾镰孢、黑孢菌和T.reesei的疏水蛋白样品获得了最高响应。
实施例2．得自大麦样品的疏水蛋白的测定大麦经受实施例1的镰孢属菌株和T.reesei菌株的污染达两周。通过将50g大麦/100ml水混合1分钟制备了大麦提出物。在4000g的速度下将大麦-水混合物离心15分钟。采集上清液提取物，通过应用制备的抗T.reesei疏水蛋白的抗体的直接ELISA法测定含于其中的疏水蛋白。
在微量滴定板上，以150μl/孔的量吸移已稀释至1/0和1/100的大麦提出物。稀释液是在磷酸钠缓冲液(10mM pH7.3的磷酸钠，150mM氯化钠=PBS溶液)中制备的。将所述板在冰箱中放置一夜。当日，以100μl/孔的量将包含0.1％牛血清白蛋白和0.05％吐温20溶液(=BSA/PBS溶液)的PBS溶液吸移到所述板上。将该板在低温下保存一夜，随后用加入其中的含0.01％吐温20溶液的PBS溶液(PBST溶液)洗涤。从疏水蛋白抗体，用BSA/PBS溶液配制了1/100稀释液。以100μl/孔吸移该抗体稀释液至所述板上，在+37℃下将该板保温2h。用PBST溶液洗涤该板。接着，吸移100μl/孔的下列结合物至该板上已用BSA/PBS溶液稀释到1/1000的、山羊的抗兔1gG碱性磷酸酶。在+37℃下将该板保温2h，再用PBST溶液洗涤该板。最后，吸移100μl/孔的下列底物至该板上1片对-硝基苯磷酸/5ml二亚乙胺+MgCl2缓冲液。在室温下的振荡器中将该板保温30min。应用Multiscan光度计测定405nm波长处的吸光度。色度与样品中包含的疏水蛋白量成正比。表1列出了所述大麦样品的吸光度值。
表1
从被Gibberella avenacea、早熟禾镰孢和T.reesei霉菌菌株污染的大麦样品测得了最高疏水蛋白含量。
本方法也很适合麦芽样品。
实施例3．啤酒喷涌试验啤酒喷涌试验是通过将0.5～1ml疏水蛋白样品加到啤酒瓶中而进行的。在室温下将该瓶振荡3天，随后开启瓶，从该瓶的重量变化测定涌出的啤酒量。
T.reesei(菌丝体提取)和早熟禾镰孢(对培养液鼓泡)的疏水蛋白样品引起特别强烈的喷涌。前一个样品引起的喷涌甚至多于50％，后一个样品引起的喷涌为30～45％。黑孢菌(菌丝体提取)的疏水蛋白样品引起1～10％的反复喷涌。试验的其它霉菌的疏水蛋白样品也引起不同程度的啤酒喷涌。
基于进行的试验的结果，可以说明疏水蛋白蛋白质引起啤酒的喷涌。
实施例4．疏水蛋白测序应用反相HPLC色谱法(高效液相色谱法)(装置_kta Explorer,Pharmacia Biotech柱C4,Vydac)分级分离实施例1中引起啤酒喷涌的早熟禾镰孢(对培养液鼓泡)和黑孢菌(菌丝体提取)疏水蛋白样品。应用的操作缓冲液是0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液(A)和0.1％TFA乙腈溶液(B)。梯度展开，于是用缓冲液A开始操作，在操作过程中增大缓冲液B的比例，以致最后的操作溶液只包含缓冲液B。当缓冲液B的浓度约为50％时，洗脱蛋白质(例如疏水蛋白)。从获得的级分，通过Phast装置(Pharmacia)应用20％Phast凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。对包含疏水蛋白那样大小的蛋白质的级分进行了N端序列分析。疏水蛋白中的氨基酸顺序的一个特征是，有八个半胱氨酸残基位于下式的蛋白质中(Wessels,J.G.H.(1996)“真菌疏水蛋白在界面起作用的蛋白质，”植物科学动向，1∶9～15):
X2～38-C-X5～9-C-C-X11～39-C-X8～23-C-X5～9-C-C-X6～18-C-X2～13X=除半胱氨酸之外的氨基酸C=半胱氨酸Cys。
就所述样品级分来说，获得了下列部分N端序列早熟禾镰孢TPPGYGGGGGGSGSNFDA C PGALYSQTQ CC SAGVG-DIVDV…即X18-C-X9-C-C…黑孢菌TNDQPATGFVA C ANNGVLFSAPN CC ATDVLGLADLD CTTPPKVPTSPXDFQ…即X11-C-X11-C-C-X11-C…T=Thr,P=Pro,G=Gly,Y=Tyr,S=Ser,N=ASn,F=Phe,D=Asp,A=Ala,L=Leu,Q=Gln,V=Val,I=Ile,K=Lys.
所述样品的序列与疏水蛋白的序列式很好地相符。当将黑孢菌的样品级分加到啤酒中而进行喷涌试验时，有一半啤酒涌出了。不含任何疏水蛋白那样大小的蛋白质的级分不产生任何喷涌。
本发明不限于其上述的实施方案，而是可能在权利要求定义的本发明的范围内作很多改变。
权利要求
1．用于测定饮料的喷涌因子的方法，其特征在于，疏水蛋白的量是从所述饮料的原料和/或从所述饮料测定的。
2．权利要求1的方法，其特征在于，啤酒的喷涌因子是通过测定来自谷物、麦芽和/或啤酒的疏水蛋白的量而确定的。
3．权利要求1或2的方法，其特征在于，所述疏水蛋白是应用疏水蛋白抗原和抗体之间的免疫反应而免疫法测定的。
4．权利要求1～3任一项的方法，其特征在于，疏水蛋白是通过ELISA法、EBStrALISA法和/或免疫层析法测定的。
全文摘要
本发明涉及测定饮料的喷涌因子的方法,在该方法中,疏水蛋白的量是从所述饮料的原料和/或从所述饮料测定的。疏水蛋白的测定是应用疏水蛋白抗原和抗体之间的免疫反应而免疫法进行的。
文档编号G01N33/569GK1300364SQ99806039
公开日2001年6月20日 申请日期1999年4月9日 优先权日1998年4月17日
发明者A·海卡拉, T·萨林, T·纳卡里-赛塔拉, M·潘提拉 申请人:酿造实验室股份公司