治疗剂和测定的制作方法

专利名称：治疗剂和测定的制作方法
治疗剂和测定本发明涉及用于治疗细胞增殖疾病或疾患的剂，和用于鉴定所述剂的测定。细胞周期检验点被认为包括监督机制，该监督机制起作用以防止受损DNA的复制或受损染色体的分离。诸如共济失调性毛细血管扩张症和Mjmegen断裂综合征的、与检验点缺陷有关且特征为遗传不稳定性和肿瘤的高发病率的遗传疾患突出了所述监督机制在维持基因组稳定性中的重要性。最近，已清楚的是，根据缺陷的细胞周期表型初始鉴定的检验点基因更广泛地参与以影响响应于染色体损伤存在的协调的细胞反应，虽然细胞周期停滞和DNA修复的进程之间的关系还不是非常确定。先前已发现哺乳动物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chkl在哺乳动物细胞中参与控制 G2/M检验点。在最近的研究中，本发明人已表明Chkl是感知停滞的复制叉和电离辐射诱导的双链断裂的途径的信号传递组分，且Chkl的一个功能是当从S期早期启动(firing)的起点的合成被抑制时保证晚期启动的复制起点的激活被阻遏。重要的是，已发现当复制叉进程减慢或受阻碍时Chkl还起作用以稳定复制机器的组分。具有缓慢移动或停滞的复制叉的细胞中Chkl功能的缺少导致复制叉中止。在停滞的复制叉失去进一步延伸的能力的地方，复制蛋白从合成的位点解离。已知响应于DNA损伤或复制停滞的Chkl的激活包括其通过DNA激活PIK激酶家族成员ATM(DNA损伤)和ATR(复制停滞)在多个残基处的磷酸化。ATM或ATR是体外Chkl 磷酸化和体内Chkl磷酸化所必需的，然而它们对于有效且及时的体内Chkl磷酸化是不足的。Claspin最初被鉴定为爪蟾卵提取物中的蛋白，其与Chkl紧密结合，且当其缺失时，在复制抑制剂蚜栖菌素存在下导致无法产生ATR介导的Chkl的磷酸化和激活。在复制起始过程中Claspin被装载到DNA复制起点，且推测Claspin在初始起点解旋之时但DNA 合成起始之前进行结合。爪蟾卵提取物的研究表明Claspin装载需要Cdc45的存在，Cdc45 是在Cdk2存在下促进起点DNA初始解旋的因子。该步骤之后为RPA结合，其是募集PCNA 和DNA聚合酶α和δ的先决条件。由于RPA不是Claspin结合所必需的，推测Claspin 在初始起点解旋之时但DNA合成起始之前进行结合。认为Claspin与复制叉机器有关，在其中Claspin可作为检验点传感蛋白(checkpoint sensor protein)。虽然与复制叉有关， Claspin并非必需的DNA复制因子。BRCAl的种系突变是许多遗传性乳腺癌病例的原因。BRCAl的一个缺陷的种系拷贝导致癌症易患性，而来自易患个体的肿瘤的细胞中第二个等位基因始终是丢失的。BRCAl 缺陷的细胞经受染色体结构的自发畸变。该发现表明BRCAl是维持染色体结构并从而抑制基因组不稳定性所必需的。然而虽然多年来进行了大量研究，BRCAl维持基因组稳定性的作用机制仍不清楚。最近的证据表明BRCA-I缺陷的细胞中出现的染色体大规模重排可能并非因DNA 修复的失败所导致，而是S期内的畸变事件过程中和作为S期内的畸变事件的结果而发生的不正确的损伤修复所导致。BRCA-I缺陷的啮齿类动物细胞和人类肿瘤是同源重组缺陷的，但保留进行易错的非同源末端连接的能力，同源重组是S期过程中可能无错的修复途径。因此，因为加工的优选路径是不可获得的，BRCAl-缺陷的细胞中自发的染色体损伤或诱导的染色体损伤可能改变修复路径为易错机制。在世界范围的女性中，乳腺癌是癌症相关死亡率的首要原因。用于治疗乳腺癌的药物的目前市场规模(market size)被评估为33亿美元。在美国，全部乳腺癌的5_10%与遗传性的遗传异常有关。最常见的遗传异常涉及基因BRCAl和BRCA2。许多乳腺肿瘤过表达激素或生长受体，对于适当的受体拮抗剂/抑制剂的开发已进行了大量研究。最近的大量开发包括将受体拮抗剂here印tin(例如，Genentech的赫塞汀(Herceptin)禾口 Genentech/Roche 的阿瓦斯汀(Avastin)(贝伐单抗(bevacizumab))) 成功引入到市场，其具有对抗散发肿瘤的显著效力，散发肿瘤的增殖取决于HER2蛋白的存在。GlaxoSmithKline的Tykerb (拉帕替尼(Iapatinib)，双重酪氨酸激酶抑制剂)将扩展 HER-2阳性的、赫塞汀-难治型的、局部晚期的和转移性的患者的治疗选择，并于2007年3 月获FDA批准。由于估计患者中的40%是赫塞汀-难治型的，Tykerb的使用将是有意义的。2006年时，乳腺癌情报来源(pipeline)中至少存在144个候选物，其中26个是预期将使激素受体或最近鉴定的下游组分失活的分子靶向治疗物(MTT)。由于一些MTT的细胞抑制性质，当与细胞毒性剂组合时将可能实现显著的肿瘤消退。开发中的许多细胞毒性剂是目前上市的那些的新配方(reformulation)，试图降低毒性水平并从而降低其使用常带来的严重副作用，或试图使其容易施用。对于所谓“受体阳性”肿瘤仍存在高度未满足的需求。与许多类型的癌症相似，乳腺肿瘤生长是多因素疾病，对于患者没有标准化的药物治疗可用。生存率是易变的，且在转移性情形下，总生存率仍为5年以下。细胞毒性剂和抗激素剂仅起作用以减慢转移性疾病的进程。对患有转移性疾病的患者具有低水平毒性的治愈治疗是急需的，且具有高度特异性靶标的药物的出现可能改变该状况。此外，针对患者基因型定制的治疗将是有利的。此外，虽然12年前已鉴定BRCAl和BRCA2为导致遗传性乳腺癌的基因，对于对该疾病具有遗传易患性的个体的治疗的开发仍具有极少进展。所述个体占所有乳腺癌病例的 5-10%。这种进展的缺少很大程度上由于(i)持续缺少对这些基因的突变形式如何导致细胞变为转化的细胞的认识；和(ii)目前为止缺乏相关的策略以在哺乳动物组织中探索正常细胞和癌细胞之间的遗传生物学差异以杀死癌细胞而保留正常细胞。具有BRCAl异常的女性中的乳腺癌主要是受体阴性的且具有高等级的细胞生长， 表明高度未满足的需求。这两种特点意味着预防性乳房切除术、传统化学疗法或化学疗法和乳房切除术的组合仍为目前治疗这些患者的主要方法。由于目前化学疗法的毒性和外科手术方法相对明显的心理社会影响，所述方法对于患者生存具有显著的局限性，且对于患者的生活质量具有重要影响。虽然鉴定参与遗传性乳腺癌的基因的前景将带来潜在的治疗齐U，但存在很少(如果有的话)明显的情报来源，且因此在整个市场的显著部分中，对于预期探索遗传状况以获得治疗作用的新型药物存在着大量潜在的市场。本发明人已鉴定了称作Claspin的基因产物的新作用，其作用是在DNA复制的关键进程中与BRCAl协作维持细胞的生存力。对癌症(且尤其是乳腺癌)的发生具有易患性的个体遗传了 BRCAl或BRCA2中的一个功能性形式和一个非功能性形式。这样的个体称作相关BRCA基因的杂合携带者。目前在一般高加索人群中BRCAl杂合携带者的评估为约千分之一，且最近对于22个基于群体&基于医院的研究的分析显示除其他癌症诸如结肠癌、子宫颈癌、子宫癌、胰腺癌和前列腺癌的增高的风险之外，到70岁年龄的BRCAl-突变携带者中的平均累积风险对于乳腺癌为65%，且对于卵巢癌为39%。在将最终导致疾病的发作的转化过程中，出现已丢失相关BRCA基因的第二功能性形式的细胞。本发明人已发现，缺少BRCAl的两个拷贝并缺少Claspin的癌细胞对用于化学治疗干预的剂(诸如暂时性地干扰DNA复制的剂)非常敏感。数据表明在这样的情形中，这些细胞是不能存活的，不能经历任何另外的增殖而死亡。相比之下，保留Claspin或BRCAl 的一个正常拷贝的细胞对这样的治疗相对不敏感。由此得出结论，在癌症患者(例如，遗传性乳腺癌患者)中，预期包括与特定的 Claspin抑制剂组合的抗肿瘤剂(比如DNA复制的抑制剂)的组合疗法具有高治疗指数 (且无疑高于目前的治疗)，其通过选择性地阻止缺少BRCAl的两个拷贝(即，肿瘤中)的那些细胞的增殖，同时对于保留BRCAl基因的一个功能性拷贝的正常的周围组织具有极小影响。在本发明中，应理解的是，权利要求书或说明书中任何称及“BRCA”是指BRCA的一种或两种形式，即BRCAl和BRCA2。优选地，BRCAl是首要感兴趣的BRCA形式。因此，本发明涉及潜在的药物靶标的鉴定、具有消除靶标的效力的先导分子(例如，基于siRNA的先导分子)的鉴定和适宜于鉴定可能用于治疗癌症(例如，乳腺癌)的其他常规小分子剂的测定。本发明人已建立了快速和稳健的测定，其能够评估化合物干扰Claspin和BRCAl 作用的能力。连同对这些蛋白的已知作用的认识，本发明使得能够筛选化合物文库的独特位置，预期其中的一些化合物可干扰与染色体完整性有关的相关功能，并作为干扰肿瘤特异性生长的结果。并且，本发明人已鉴定了能够阻止Claspin功能，因此充当可用于开发临床先导的先导化合物的小分子。因此，在本发明的一个实施方案中，提供用于治疗细胞增殖疾患的claspin调节剂。在另一方面，提供与至少一种抗肿瘤剂组合的claspin调节剂，以用于治疗细胞
增殖疾患。在所述治疗过程中，claspin调节剂与抗肿瘤剂的组合可以是复合的 (combined)、顺序的或同时的。优选地，细胞增殖疾患与受损的BRCA功能有关，比如癌症，特别是但不仅是乳腺癌。因此，本发明的调节剂可用于治疗预先确定患有癌症的动物。在本发明的一些方面中，claspin调节剂是claspin特异性抗体或claspin特异性核酸调节剂。优选地，调节剂调节claspin的活性或表达。优选地调节剂是抑制剂，比如 RNA抑制剂或反义寡聚物。在本发明的另一个实施方案中，提供claspin调节剂连同抗肿瘤剂在制备包含调节剂和抗肿瘤剂，用于复合施用、顺序施用或同时施用用于治疗细胞增殖疾病的药物中的用途。还提供包括claspin调节剂的药物组合物。任选地，药物组合物还可含有抗肿瘤齐U，和/或另外的生理上可接受的赋形剂或佐剂。在本发明的可使用抗肿瘤剂的实施方案中，抗肿瘤剂可以是选自由以下组成的组的剂甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、硫替哌、丝裂霉素C、氮丙啶基苯醌(AZQ)、白消安、 卡氮芥(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、福莫司汀、卡钼、道诺霉素、多柔比星或亚德利亚霉素、表柔比星、更生霉素或放线菌素D、米托蒽醌、安吖啶、替尼泊苷、依托泊苷、伊立替康、托泊替康、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、紫杉醇、泰索帝，和其混合物。在本发明的另一个实施方案中，提供纯化的claspin抑制剂。优选地所述抑制剂是claspin特异性抗体或claspin特异性核酸调节剂。本发明涉及用于利用小核酸分子通过RNA干扰(RNAi)调节例如claspin的表达和活性的化合物、组合物和方法。特别地，本发明特征为小核酸分子，比如短干扰核酸 (siNA)分子、短干扰RNA (siRNA)分子、双链RNA (dsRNA)分子、微小RNA (miRNA)分子和短发夹RNA(shRNA)分子和用于调节claspin基因表达的方法。本发明的SiNA可以是未经修饰的或经化学修饰的。本发明的SiNA可以用化学方法合成、从载体中表达或用酶促方法合成。在一个实施方案中，本发明特征为下调claspin基因表达的双链短干扰核酸 (siNA)分子，其中所述siNA分子包括约15个至约28个碱基对。在一个实施方案中，本发明特征为经由RNA干扰(RNAi)指导claspin RNA的切割的双链短干扰核酸(siNA)分子，其中所述双链siNA分子包括第一链和第二链，siNA分子的每条链为约18个至约28个核苷酸长度，siNA分子的第一链包括对claspin RNA具有足够互补性的核苷酸序列以用于siNA分子经由RNA干扰指导claspin RNA的切割，且所述siNA 分子的第二链包括与所述第一链互补的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，SiNA分子包括反义链，所述反义链包括与编码 claspin蛋白的mRNA序列或其部分互补的核苷酸序列。任选地，siNA还包括有义链，其中所述有义链与所述反义链互补。在一个实施方案中，claspin siNA构建体的反义区包括与具有SEQ ID NO. 1、3、5 和7中任一个的序列互补的序列。在一个实施方案中，claspin构建体的反义区包括具有 SEQ ID NO. 2、4、6、8、9、10、11、12和13中任一个的序列。在其中提供siNA双链体的另一个实施方案中，claspin构建体的有义区包括具有SEQ ID NO. 1、3、5、7中任一个的序列，和与 SEQ ID NO :9-13互补的序列。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括SEQ ID NO. 1-13 中的任一个。在本发明的一个实施方案中，提供RNA，所述RNA包括SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、 11、12或13的序列，或由SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12或13的序列组成，或基本上由 SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12 或 13 的序列组成。优选地，序列为 SEQ ID N0:9、10、ll、 12或13其中之一。在一些实施方案中，可提供相对于SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12或13序列具有多种碱基取代、添加或缺失的序列。优选地，任何取代、添加或缺失将不会使RNA作为针对claspin mRNA的反义分子的功能受到显著损害。优选地，被添加、缺失或取代的碱基的数目将仅约为1个、2个或3个碱基。如以下更详细地描述的，经由例如在不同的严格度下的杂交检验可检验反义分子保持为可行的反义分子的能力。在一个优选的方面，对RNA反义分子的任何添加的碱基将与claspin mRNA互补。在本发明的一个实施方案中，SiNA分子包括具有约15个至约30个(例如，约15 个、1Θ个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的反义链，其中反义链与编码claspin蛋白的RNA序列或其部分互补，且其中任选地，所述siNA还包括具有约15个至约30个(例如，约15个、16个、17个、18个、 19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)核苷酸的有义链，且其中所述有义链和所述反义链是不同的核苷酸序列，其中每条链中至少约15个核苷酸与另一条链互补。在本发明的另外的实施方案中，提供在反义链中具有约21个核苷酸的SiNA分子， 任选地在序列的5’端和/或3’端+/-1个或2个核苷酸。制造SiNA双链体的方法是本领域技术人员熟知的。例如，本发明的核酸分子可分别来合成并在合成后将其接连在一起，例如，通过连接(ligation) (Moore等人，1992， Science 256，9923 ；Draper 等人，国际 PCT 公布第 WO 93/23569 号；Shabarova 等人，1991， Nucleic Acids Research 19，4247 ;Bellon 等人，1997，Nucleosides & Nucleotides, 16， 951 ；Bellon等人，1997，Bioconjugate Cl je7n. 8，204)，或通过合成和/或脱保护后的杂交来接连。本发明的SiNA分子还可经由串联合成方法来合成，其中两条SiNA链被合成为由可裂解的连接物隔开的单一连续寡核苷酸片段或链，所述可裂解的连接物随后被裂解以提供进行杂交的分离的siNA片段或链，并允许siNA双链体的纯化。连接物可以是多核苷酸连接物或非核苷酸连接物。siNA的串联合成可易于适合于多孔合成平台/多板合成平台诸如96孔或相似地较大的多孔平台。siNA的串联合成还可易于适合于应用批量反应器、合成柱和类似物的大规模合成平台。siNA分子还可从两个不同的核酸链或核酸片段来组装，其中一个片段包括RNA分子的有义区且第二个片段包括RNA分子的反义区。在本发明中，抑制剂可以是具有以下任何序列的claspin特异性核酸调节剂(SEQID NO 1)5 ‘ -GCAGAUGGGUUCUUAAAUGUU-3‘+++++++++++++++++++3 ‘ -UUCGUCUACCCAAGAAUUUAC-5‘(SEQID NO 2)(SEQID NO 3)5 ‘ -GAGUAGAUGUUUCCAUUAAUU-3‘+++++++++++++++++++3 ‘ -UUCUCAUCUACAAAGGUAAUU-5‘(SEQ ID NO 4)(SEQ ID NO 5)5 ‘ -GCAGAUA⑶CCUUCAGAUAUU-3‘+++++++++++++++++++
3 ‘ -UUCGUCUAUCAGGAAGUCUAU-5‘(SEQ ID NO 6)(SEQ ID NO 7)5 ‘ -GAAGACAGGCUCACUGCUAUU-3‘+++++++++++++++++++3 ‘ -UUCUUCU⑶CCGA⑶GACGAU-5‘(SEQ ID NO 8)在本发明的一个实施方案中，SiRNA双链体中的一个或多个被用来抑制claspin。在另一个实施方案中，SiRNA反义链(SEQ ID NO :2、4、6、8)中的一个或多个被用来抑制claspin。在本发明的另一个实施方案中，4个不同的SiRNA双链体分子中的每一个的混合物被用来消除(ablate) claspin。在本发明的一个优选的实施方案中，提供包括SEQ ID NO :9、10、11、12或13的序列。那些序列中的一个或多个，可单独地或组合地被用来抑制claspin功能。(SEQ ID NO 9)5 ‘ -GACA⑶GAUUCCGAAACAGUU-3‘(SEQ ID NO: 10)5' -GCAACUGGGAGUAGAUGUUUU-3‘(SEQ ID NO 11)5 ‘ -CAGAUGAAAACUCAGGCAAUU-3‘(SEQ ID NO: 12)5 ‘ -GUUGAAAAGGCAAAUGAGGUU-3‘(SEQ ID NO: 13)5 ‘ -UCGUCUAA⑶CUCAGGUAAUU-3‘在一个优选的实施方案中，还提供包括SEQ ID NO :9至13的序列和它们各自的互补序列的双链体。在本发明的一个优选的实施方案中，提供鉴定claspin调节剂或调节参与DNA复制进程的Claspin依赖性控制的下游组分的剂的体外方法，所述方法包括以下步骤(a)提供测定系统，所述测定系统包括claspin多肽或核酸或其功能活性片段或衍生物；(b)将所述测定系统与受试剂接触；和(c)检测所述测定系统中claspin的表达或活性，其中claspin的表达或活性在存在受试剂时与不存在受试剂时相比其间的差异将受试剂鉴定为claspin调节剂。在这方面，优选地利用测定来确定受试剂是否是claspin抑制剂。为确定一种剂是否是claspin调节剂，优选地测定系统包括表达claspin多肽的培养的细胞。所述细胞的非穷尽性的例子是HeLa细胞、U20S细胞或MCF-7细胞。任选地，细胞可以是BRCAl杂合的细胞(例如，MDA-MB-231细胞)或BRCA缺失的细胞(例如，HCC1937、SUM1315M02)。在一些实施方案中，细胞可以是已另外地经受claspin的消除的BRCA杂合的细胞或BRCA缺失的细胞。
在一个实施方案中，在添加受试剂之前通过不同的方案测量测定系统中claspin 的功能(例如，claspin的表达和/或活性)。可使用的方案的例子是体外方案，诸如利用例如电泳迁移率变动测定(EMSA)或酶联免疫测定与支链DNA的特异性结合，或，例如通过经由免疫共沉淀与Chkl多肽的特异性结合。可选地，可进行体内方案，例如，通过mRNA水平的定量PCR分析、Claspin蛋白的免疫印迹、Chkl与claspin的免疫共沉淀的分析、Chkl磷酸化的速率和程度的分析、和/或通过FACS或间接免疫荧光显微术对复制压力存在下复制体稳定性的分析。在一个优选的实施方案中，claspin活性是通过将Claspin募集到固定的、支链DNA的程度来测量的。所述测量提供了读数，随后从所述读数可对比添加受试剂之后 claspin活性的任何改变。测定系统可包括claspin多肽或核酸，然后将所述claspin多肽或核酸与受试剂接触。所述受试剂可以是能够调节claspin (多肽或核酸)的活性和/或表达的任何剂，诸如通过干扰claspin的DNA结合功能来调节，且优选地为小分子诸如化学化合物或其复合物、抗体或核酸抑制剂，诸如双链RNA、反义寡聚物、PMO或任何其他类型的干扰RNA。在本发明的方法中，通过本领域技术人员已知的任何适宜的方法将受试剂与 claspin接触。优选的方法为如下所述(i)在存在或不存在DNA或Chkl时将溶液中的受试剂加入到含有重组Claspin的溶液；(ii)将溶液中的受试剂加入到含有表达claspin的细胞的溶液；(iii)通过破坏细胞膜将受试剂导入到表达claspin的细胞中；(iv)通过首先将受试物质加入到能够与细胞膜融合的分子装置(例如，阳离子脂质体)中而将受试剂导入到细胞中。将理解的是，可使用获得使受试剂与claspin接触成为可能的期望效果的任何方法。受试剂与claspin或表达claspin的细胞的接触可持续进行任何适宜的时间量， 优选地为足以使受试剂对claspin的表达和/或活性具有一定作用的时间量。例如，如果测定中使用了表达claspin的细胞，则与测定中使用纯化的claspin相比，测定系统中可能需要更大的时间量来确保受试剂已与claspin接触(如，因为剂可能不得不穿过细胞/核的膜)。受试剂可留在测定系统中的典型的时间量为约0至10小时。例如，约20分钟至约10小时、约20分钟至约2小时、约20分钟至约1小时、约1小时至约8小时、约2小时至约4小时。并且，受试剂与claspin的接触可在与本发明最常用的环境相似的条件(例如，温度、PH，等等)下进行，比如在动物体的条件下进行，优选地为人体。当在适宜的条件下，将受试剂与claspin接触适宜的时间量后，利用与用于测量 claspin的参考值相同的方案再次测量claspin的表达和/或活性。以这种方式，可获得将显示claspin的功能(例如，活性和/或表达)是否被调节的对比性结果。在该方面，活性和/或表达可以是上调的、下调的或可以保持不变。如果功能保持不变，则所筛选的受试剂可能不是claspin调节剂。在本发明中，优选的受试剂是下调claspin的受试剂。
已鉴定claspin调节剂后，则可将所述调节剂用于如本文所进一步讨论的本发明的另外的实施方案中。在一个优选的实施方案中，方法包括(a)将其中BRCA和claspin功能基本上正常的第一细胞群体与受试剂接触；(b)将其中BRCA被消除但其中claspin是功能性的第二细胞群体与受试剂接触；(c)将所述第一细胞群体和所述第二细胞群体暴露于复制压力；和(d)确定所述受试剂对第一细胞群体和第二细胞群体的复制、增殖或存活的作用。优选地BRCA 是 BRCAl。当受试剂降低了第二群体(即，其中已消除BRCA1)的增殖或存活，但对第一群体(即，其中BRCAl仍是功能性的)具有降低的或较不显著的作用时，这表明受试剂是 claspin或其下游途径的成员的特异性抑制剂，但不影响BRCAl或其下游途径。因此所述方法允许鉴定可潜在地靶向其中已消除BRCAl的细胞(例如，癌细胞)，而留下其中BRCAl仍是功能性的细胞(即，正常细胞)的先导化合物。这提供了通过利用其中claspin和BRCAl 均缺陷的细胞中实现的合成致死(synthetic lethality)而针对BRCAl缺陷的癌症的靶向疗法的可能性。合成致死发生在两个或多个基因或其蛋白质产物的缺陷组合导致细胞死亡之时，而任何一个的缺陷不会导致细胞死亡，且其单独被称为存活的。BRCA和claspin功能为“基本上正常的”或“功能性的”，意为所述功能是使BRCA 和claspin在提供存活的和功能性的细胞的水平表达。BRCA在细胞中为“消除的”，其意为BRCA的功能被减小达细胞实际上无BRCA功能的程度。例如，可减少BRCA mRNA的量到达阻止BRCA发挥功能的程度。由于细胞内大量基因、蛋白和途径的冗余性，这可能不会立即表现出，但当将因子或因子的组合应用于细胞而使其在无“被消除的”基因或基因产物的情况下不再存活或具有功能性时将变得明显。本领域技术人员将容易地能够确定细胞中BRCA或claspin的功能(例如，表达和 /或活性)是“正常的”还是“消除的”。确定所述条件的典型方法是，通过例如mRNA定量或蛋白定量，其是技术人员所容易理解和能够进行的。作为mRNA定量的例子，可通过给出关于mRNA分子的大小和序列信息的Northern 印迹定量地测量mRNA的水平。通常，在琼脂糖凝胶上分离RNA的样品，并将其与同靶序列互补的放射性标记的RNA探针杂交。然后通过放射自显影检测放射性标记的RNA。用于测量mRNA丰度的可选的和低通量的方法是逆转录定量聚合酶链式反应 (RT-PCR，其后为qPCR)。RT-PCR首先通过逆转录从mRNA生成DNA模板(cDNA)。然后该 cDNA模板用于qPCR，其中探针的荧光改变随DNA扩增过程进展发生改变。利用仔细构建的标准曲线，qPCR可以产生绝对测量结果，诸如mRNA的拷贝数，通常以每纳升勻浆组织的拷贝或每细胞的拷贝为单位。可选地，可使用DNA微阵列技术来测量基因的转录水平。可选地，可使用“基于标签的”技术如基因表达系列分析(SAGE)，其可提供不同信使RNA的细胞浓度的相对量度。作为蛋白定量的例子，蛋白定量的常规方法是针对感兴趣的蛋白进行蛋白质印迹——这除其身份之外还提供蛋白的大小的信息。通常，在聚丙烯酰胺凝胶上分离样品(常为细胞裂解物)，转移到膜上，且然后用针对感兴趣的蛋白的抗体进行探针检测。抗体可与荧光团轭合或与辣根过氧化物酶轭合以进行成像和/或定量。
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蛋白定量的可选的方法是，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA通过使用固定于微量滴定板上的抗体从添加到孔中的样品中捕捉感兴趣的蛋白来工作。利用与酶或荧光团轭合的检测抗体，可通过荧光检测或比色检测精确地测量所结合的蛋白的量。该检测过程与蛋白质印迹的检测过程非常相似，但由于避开了凝胶步骤可实现更精确的定量。在本发明的某些实施方案中，预料将实现BRCA和/或claspin “正常”，且其功能约为或至少为BRCA和/或claspin是功能性的细胞中功能的50%、60%、70%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%和 100% 以上，所述细胞比如 HeLa 细胞。在本发明的某些实施方案中，如果BRCA功能是特定细胞功能和细胞存活所必需的，预料BRCA功能与其中BRCA是功能性的正常细胞(比如HeLa细胞)相比小于30%、 20%,10%,5%,4%,3%,2%U0%，将对细胞是有害的。用于第一群体和第二群体的适宜的细胞群体对于本领域技术人员将是明显的。其中已消除BRCAl的适宜细胞系是BRCA缺失细胞HCC1937和SUM1315M02，但其他细胞系对于本领域技术人员将是明显的。其中BRCA和claspin是功能性的适宜细胞系包括HeLa、 U20S细胞或MCF-7，但其他细胞系对于本领域技术人员将是明显的。本领域中的常规做法是在细胞中敲除或敲低特定基因的表达，且因此提供具有所期望的性质的另外的细胞在本领域技术人员的能力范围内。第一细胞群体和第二细胞群体与受试剂的接触可持续进行任何适宜的时间量，优选地为足以使受试剂对claspin的功能(例如，表达和/或活性)具有一定作用的时间量。 受试剂可留在测定系统中的典型的时间量为约0至10小时。例如，约20分钟至约10小时、 约20分钟至约2小时、约20分钟至约1小时、约1小时至约8小时、约2小时至约4小时。并且，受试剂与细胞群体的接触可在与本发明最常用的环境相似的条件(例如， 温度、PH，等等)下进行，比如在动物体的条件下进行，优选地为人体。当在适宜的条件下将受试剂与细胞群体接触适宜的时间量之后，使细胞群体经受引起复制压力的条件。存在多种可将细胞暴露于复制压力的方法，但最适用于本发明的是化学方法或电离辐射。对于将细胞置于复制压力下的优选的剂是羟基脲(HU)。优选地，将细胞置于复制压力下的方法通过适当的抗肿瘤剂来实现，诸如可能已经用于抗癌疗法中的抗肿瘤剂。这可提供评估可最终用于临床环境的受试剂与抗肿瘤剂的可能的组合疗法的可能结果的优点。而且，细胞群体暴露于复制压力持续足以阻碍或干扰DNA复制的时间量。对于化学暴露，所述时间的范围可从大约几分钟到若干小时。适宜地，通过鉴定群体内细胞周期已停滞的细胞的数目或比例来确定受试物质抑制复制或存活的能力。特别感兴趣的是其中细胞周期已在S期停滞的细胞。研究细胞周期中细胞的状态的优选的方法是FACS。已知DNA合成的整体速率受活性起点的数目以及在复制叉处运作的复制机器的固有催化速率所控制。分析复制能力的一个方法是，评估细胞在简短的脉冲标记(pulse) 过程中掺入卤代脱氧核苷酸诸如BrdU(Sigma-Aldrich)的能力，作为它们在S期的精确位置的函数。脉冲时间的范围可从几分钟到若干小时，但优选地脉冲时间在约15分钟至60 分钟的范围中，优选地为20分钟至40分钟，优选地约30分钟。将每个细胞中掺入BrdU的量对该细胞的DNA含量绘制曲线的总细胞群体分析产生了特征性圆弧，允许精确确定处于细胞周期的Gl期、S期和G2/M期的细胞的比例。特别地，复制能力失败的程度可通过测量每个样品群体中处于S期但完全不能掺入BrdU的细胞的比例来定量(例如，对应于图3中感兴趣的区域(RoI))，所述处于S期是通过所述细胞具有Gl细胞和G2细胞中间的DNA含量来判断的。以这种方式，本发明可提供测定以确定化合物是否是claspin抑制剂，并因此确定那些化合物是否可用于治疗某些疾病状态(例如，癌症)的治疗(例如，单独的或组合的治疗)中。受试化合物可以是新颖的化合物(例如，先前未知的化合物)，或它们可以是已知的化合物(例如，已用于治疗中)。例如，如果化合物是已知的，则本发明可提供测定以确定那些已知的分子是否是claspin抑制剂，且因此提供改进现有治疗性治疗的潜在的快速且成本有效的途径——通过确定已批准用于人体或动物体的药物是否可用于与例如抗肿瘤剂一起的组合疗法中，以提高那些剂治疗某些疾病状态(例如，癌症)的效力。在本发明的另一个实施方案中，提供一种方法，比如体外方法，以用于调节具有 BRCA基因缺陷的细胞的存活，所述方法包括将细胞与claspin抑制剂接触。优选地，还可将细胞与抗肿瘤剂接触。如本文所用的，术语“claspin多肽”指全长claspin蛋白或其功能活性片段或衍生物。claspin多肽可以是例如Genbank登录号AAG24515. 1中所指的。“功能活性的” claspin片段或衍生物表现出与全长的野生型claspin蛋白相关的一种或多种功能活性，比如抗原活性或免疫原活性、酶活性、结合天然细胞底物的能力，等等。claspin蛋白、 衍生物和片段的功能活性可通过本领域技术人员已知的(Current Protocols in Protein Science (现代蛋白质科学实验方案)(1998) Coligan 等人，编，John Wiley & Sons，Inc.， Somerset,New Jersey)和如以下进一步讨论的多种方法来测定。为了本文的目的，功能活性片段还包括包含claspin的一个或多个结构域(比如结合结构域)的那些片段。蛋白结构域可利用 PFAM 程序(Bateman A.，等人，Nucleic Acids Res, 1999,27 260-2)来鉴定。 在一些实施方案中，优选的片段是功能活性的、含结构域的片段，其包括claspin的至少25 个连续氨基酸，优选地为至少50个、更优选地75个和最优选地至少100个连续氨基酸。在另外的优选的实施方案中，片段包括完整的功能活性结构域。术语“claspin核酸”指编码claspin多肽的DNA或RNA分子。claspin核酸可以是例如，Genbank登录号AF297866中所指的。优选地，claspin多肽或核酸或其片段来自人类，但还可以是与人类claspin具有至少70 %序列同一性、优选地至少80 %、更优选地85%、甚至更优选地90%、和最优选地至少95%序列同一性的其直系同源物或衍生物。 鉴定直系同源物的方法是本领域中已知的。通常，由于一个或多个蛋白基序和/或3维结构的存在，不同物种中的直系同源物保留相同的功能。一般通过序列同源性分析来鉴定直系同源物，比如BLAST分析，通常利用蛋白诱饵序列(bait sequence) 0如果来自正向 BLAST结果的最佳击中(hit)序列重新得到(retrieve)逆向BLAST中的原始查询序列，则序列被指定为潜在的直系同源物(Huynen MA和Bork P，Proc Natl Acad Sci (1998)95 5849-5856 ；Huynen MA 等人，Genome Research(2000) 10 1204-1210)。用于多序列比对的程序，比如 CLUSTAL (Thompson JD等人，1994，Nucleic Acids Res 22 :4673_4680)可用于突出直系同源蛋白的保守区域和/或残基，和用于生成系统发育树。在呈现来自不同物种的多个同源序列(例如，通过BLAST分析所检索的)的系统发育树中，来自两种物种的直系同源序列相对于来自这两种物种的所有其他序列一般在树上表现出靠近。蛋白折叠的结构串线(structural threading)或其他分析(例如，利用 ProCeryon，Biosciences，Salzburg， Austria的软件)也可鉴定潜在的直系同源物。在进化中，当物种形成之后发生基因复制事件，一个物种(诸如果蝇)中的单个基因可对应于另一物种(诸如人类)中的多个基因 (旁系同源物)。如本文所用的，术语“直系同源物”包括旁系同源物。如本文所用的，相对于目的序列或目的序列的特定部分的“序列同一性百分比 (% ) ”被定义为通过具有设定为默认值的所有搜索参数的程序WU-BLAST-2. 0al9 (Altschul 等人，J. Mol. Biol. (1997)215 403-410)所产生的，在对齐两条序列和如达到最大序列同一性百分比所需的引入空位之后，候选衍生序列中与目的序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。HSP S和HSP S2参数是动态值，且通过程序自身所确定，取决于特定序列的组成和对其搜索感兴趣的序列的特定数据库的组成。同一性％值通过将匹配的相同的核苷酸或氨基酸数目除以待报告同一性百分比的序列长度来确定。“氨基酸序列相似性百分比(％)”是通过进行与确定氨基酸序列同一性％的同样的计算来确定，但除计算中相同的氨基酸之外，包括保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是其中氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸所取代从而蛋白的折叠或活性未受显著影响的氨基酸取代。可互相取代的芳香族氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；可互换的疏水性氨基酸是亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；可互换的极性氨基酸是谷氨酰胺和天冬酰胺；可互换的碱性氨基酸是精氨酸、赖氨酸和组氨酸；可互换的酸性氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；和可互换的小氨基酸是丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。可选地，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981， Advances in Applied Mathematics 2 :482_489 ；database :European Bioinformatics Institute(数据库欧洲生物信息学研究所)；Smith和Waterman，1981，J. of Molec. Biol. ,147195-197 ；Nicholas φ A,1998, "A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods (检索序列数据库禾口序列评分方法指南)”(www. psc. edu)和其中引用的参考文献；W. R. Pearson, 1991, Genomics 11 635-650) 提供了核酸序列的比对。通过利用评分矩阵可将该算法应用于氨基酸序列，该评分矩阵由 Dayhoff JfM. (Dayhoff :Atlas of Protein Sequences and Structure (Dayhoff 蛋白· 列和结构地图集),Μ. 0. Dayhoff 编辑，5 增刊 3 :353_358，National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C.，USA)并由 Gribskov 标准化(Gribskov 1986 Nucl. Acids Res. 14(6) :6745-6763)。可使用Smith-Waterman算法，其中默认参数(例如，空位开放罚值12，空位延伸罚值2)用于评分。从所生成的数据中，“匹配”值反映“序列同一性”。目的核酸分子的衍生核酸分子包括与claspin的核酸序列杂交的序列。杂交的严格度可受杂交和洗涤过程中的温度、离子强度、PH和变性剂诸如甲酰胺的存在的控制。常规使用的条件在易于获得的方法教科书中列出(例如，Current Protocol in Molecular Biology (现代分子生物学实验方案)，卷1，第2. 10章，John Wiley & Sons, Publishers (1994) ； Sambrook 等人’ Molecular Cloning (分子克隆)，Cold Spring Harbor (1989))。在一些实施方案中，本发明的核酸分子能够在高严格度杂交条件下与含 claspin的核苷酸序列的核酸分子杂交，所述高严格度杂交条件为在含有6 X单一强度柠檬酸盐(SSC) (1XSSC 为 0. 15M NaCl、0. 015M 柠檬酸钠；pH 7. 0) ,5XDenhardt 氏溶液、 0. 05%焦磷酸钠和100g/ml鲱鱼精DNA的溶液中将含有核酸的滤膜进行预杂交，在65°C下持续8小时至过夜；在含有6XSSC、1 XDenhardt氏溶液、100μ g/ml酵母tRNA和0. 05% 焦磷酸钠的溶液中进行杂交，在65 °C下持续18-20小时；和在含有0. IXSSC和0. 1 % SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中洗涤滤膜，在65°C下持续1小时。在另外的实施方案中，使用中严格度杂交条件，其为在含有35%甲酰胺、 5XSSC、50mM Tris-HCl (pH 7.5)、5mM EDTA.O. 1%PVP,0. 1% Ficoll、1 % BSA和500 μ g/ml 变性的鲑鱼精DNA的溶液中预处理含有核酸的滤膜，在40°C下持续6小时；在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mM Tris-HCl (pH 7.5)、5mM EDTA.0. 02% PVP.0. 02% Ficoll.O. 2% BSA, 100 μ g/ml鲑鱼精DNA和10% (wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中进行杂交，在40°C下持续 18-20小时；然后在含有2X SSC和0. SDS的溶液中在55°C下洗涤两次，共1小时。可选地，可使用低严格度条件，其为在包括20%甲酰胺、5XSSC、50mM磷酸钠(pH 7. 6)、5 XDenhardt氏溶液、10%葡聚糖硫酸酯和20 μ g/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中在37°C下孵育8小时至过夜；在相同的缓冲液中杂交，持续18-20小时；和在IXSSC中在约37°C下洗涤滤膜1小时。如本文所用的，“claspin调节剂”是调节claspin功能的任何剂，例如，与claspin 相互作用以抑制或增强claspin活性或以其他方式影响正常claspin功能的剂。可在任何水平影响Claspin功能，所述水平包括转录、蛋白表达、蛋白定位和细胞活性或胞外活性。 在一个优选的实施方案中，claspin调节剂特异性地调节claspin的功能。本文所用的短语“特异性的调节剂”、“特异性地调节”等等，指与claspin多肽或核酸直接结合的调节剂， 且优选地抑制、增强或以其他方式改变claspin的功能。这些短语还包括改变claspin与结合伴侣、底物或辅因子相互作用的调节剂(例如，通过与claspin的结合伴侣结合，或与蛋白/结合伴侣复合物结合，并改变claspin功能)。而且，如本文所用的，claspin调节剂可以是调节参与DNA复制进程的Claspin依赖性控制的下游组分的剂。优选地，claspin调节剂是claspin抑制剂。优选的claspin调节剂包括小分子化合物；claspin-相互作用蛋白，包括抗体和其他生物治疗剂；和核酸调节剂诸如反义抑制剂和RNA抑制剂。可将调节剂配制为药物组合物，例如，作为如在组合疗法中可包括其他活性成分，和/或适宜的载体或赋形剂的组合物。用于制备和施用化合物的技术可见于“Remington' s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)”，Mack Publishing Co.，Easton, PA，第 19 版中。小分子常是优选的以调节具有酶功能、和/或含有蛋白相互作用结构域的蛋白的功能。本领域中所指的作为“小分子”化合物的化学剂，通常是有机的非肽分子，具有达10，000道尔顿，优选地达5，000道尔顿，更优选地达1，000道尔顿，和最优选地达500 道尔顿的分子量。此类的调节剂包括化学合成的分子，例如，来自组合化学品文库的化合物。可基于claspin蛋白的已知性质或推断的性质来合理设计或鉴定合成的化合物，或可通过筛选化合物文库来鉴定合成的化合物。可选的适当的此类调节剂是天然产物，特别是来自诸如植物或真菌的生物体的次级代谢物，其还可通过对化合物文库进行claspin调节活性的筛选来鉴定。用于生成和获得化合物的方法是本领域中熟知的(Schreiber SL, Science (2000) 151 :1964-1969 ；Radmann J 和 Gunther J, Science (2000) 151 :1947-1948)。
如以下所描述的，从筛选测定所鉴定的小分子调节剂可用作先导化合物，从所述先导化合物可设计、优化和合成候选临床化合物。所述临床化合物可用于治疗与BRCA缺陷有关的病理学。如以下进一步描述的，候选小分子调节剂的活性可通过反复的次级功能验证、结构确定和候选调节剂修饰和检验来提高数倍。此外，生成了具有特定的临床性质和药理学性质的候选临床化合物。例如，利用体外测定和体内测定可对试剂进行衍生化和重新筛选以为了药物开发优化活性和使毒性最小化。特异性的claspin-相互作用蛋白可用于与BRCA相关疾患有关的多种诊断应用和治疗应用中，以及用于其他claspin调节剂的验证测定中。在一个优选的实施方案中， claspin-相互作用蛋白影响正常的claspin功能，所述正常的claspin功能包括转录、蛋白表达、蛋白定位和细胞活性或胞外活性。在另一个实施方案中，claspin-相互作用蛋白可用于检测claspin蛋白的功能并提供关于claspin蛋白的功能的信息，因为其与BRCA相关的疾患诸如癌症有关(例如，用于诊断方法)。claspin-相互作用蛋白可以是内源性的，S卩，与claspin天然地遗传相互作用或生化相互作用的，比如调节claspin表达、定位和/或活性的蛋白。酵母双杂交和突变体筛选提供了鉴定内源性claspin-相互作用蛋白的优选的方法(Finley，R. L.等人(1996) 于 DNA Cloning-Expression Systems :A Practical Approach (DNA 克隆-表达系统实用方法)，编辑· Glover D. & Hames B. D (Oxford University Press, Oxford, England), 第 169-203 页中；Fashema SF 等人，Gene (2000) 250 :1_14 ；Drees BL Curr Opin Chem Biol (1999) 3 :64-70 ；Vidal M和 Legrain P Nucleic Acids Res (1999) 27 :919-29 ；和美国专利第5，928，868号)。质谱分析是阐明蛋白复合物的可选的优选的方法(综述于例如， Pandley A禾口Mann M, Nature(2000)405 :837-846 ；Yates JR 3rua,Trends Genet(2000) 16 5-8)。claspin-相互作用蛋白可以是外源蛋白，比如claspin-特异性抗体(参见，例如， Harlow禾口 Lane (1988) Antibodies，A Laboratory Manual (抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory ;Harlow 禾口 Lane (1999) Using antibodies -.a laboratory manual.(使用抗体实验室手册)Cold Spring Harbor, NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press) 以下进一步讨论Claspin-特异性抗体。在优选的实施方案中，claspin-相互作用蛋白特异性地结合claspin蛋白。在可选的优选的实施方案中，claspin-调节剂结合claspin底物、结合伴侣或辅因子。在另一个实施方案中，蛋白调节剂是claspin-特异性抗体激动剂或拮抗剂。抗体具有治疗应用和诊断应用，且可用于筛选测定以鉴定claspin调节剂。特异性地结合claspin多肽的抗体可利用已知方法来产生。优选地，抗体对 claspin多肽的哺乳动物直系同源物是特异性的，和更优选地，对人类claspin是特异性的。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab 片段、F(ab' )2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体和以上任何的表位结合片段。可选择尤其具有抗原性的claspin的表位，例如，通过对claspin多肽的抗原性进行常规筛选来选择，或通过将用于选择蛋白的抗原性区域的理论方法(Hopp 禾口 Wood(1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :3824-28 ；Hopp 禾口 Wood，(1983)Mol. Immunol. 20 :483-89 ；Sutcliffe 等人，(1983) Science 219 :660-66)应用于 claspin 的
16氨基酸序列来选择。可通过所描述的标准方法(Harlow和Lane，同上；Goding(1986) Monoclonal Antibodies principles and Practice (单克隆抗体原理和实践)(第二版) Academic Press, New York ；和美国专利第 4，381，292 号；第 4，451，570 号；和第 4，618，577 号)制备具有IO8 Μ"1亲和力，优选地IO9 Μ"1至IOkT1或更强的亲和力的单克隆抗体。可针对claspin的细胞粗提物或其基本上纯的片段来生成抗体。如果使用 claspin片段，其优选地包括claspin蛋白的至少10个连续氨基酸、和更优选地至少20个连续氨基酸。Claspin-特异性抗原和/或免疫原可与刺激免疫反应的载体蛋白偶联。例如， 目的多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)载体共价偶联，且轭合物乳化于增强免疫反应的弗氏完全佐剂(Freund' s complete adjuvant)中。根据常规方案对诸如实验室兔或小鼠的适当免疫系统进行免疫。利用固定的相应claspin多肽通过诸如固相酶联免疫吸附测定(ELISA)的适当的测定来测定claspin特异性抗体的存在。还可使用诸如放射免疫测定或荧光测定的其他测定。可制备含有来自不同的动物物种的不同的部分的对claspin多肽特异性的嵌合抗体。例如，人类免疫球蛋白恒定区可与鼠mAb的可变区连接，从而抗体从人类抗体得到其生物活性，并从鼠片段得到其结合特异性。嵌合抗体通过将编码来自每个物种的适当的区域的基因剪接在一起而产生(Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (1984)81 :6851-6855 ； Neuberger 等人，Nature (1984) 312 :604-608 ；Takeda 等人，Nature (1985) 31 :452-454)。人源化的抗体，其为嵌合抗体的一种形式，可通过重组DNA技术(Riechmarm LM, 等人，1988 Nature 323 :323-327)将小鼠抗体的互补决定区(CDR)嫁接到人类框架区和恒定区背景中来生成(Carlos, Τ. Μ.，J. Μ. Harlan. 1994. Blood 84 :2068-2101)。人源化的抗体含有鼠序列和人类序列，且因此进一步减少或消除免疫原性，而保留抗体特异性(Co MS, 和Queen C. 1991 Nature 351 :501-501 ；Morrison SL. 1992 Ann. Rev. Immun. 10 :239-265)。 人源化的抗体和其产生方法是本领域中熟知的(美国专利第5，530，101号，第5，585，089 号，第 5，693，762 号和第 6，180，370 号)。Claspin-特异性的单链抗体，其为重组的单链的多肽，经由氨基酸桥通过将Fv 区域的重链片段和轻链片段连接而形成，可通过本领域中已知的方法来产生(美国专利第 4，946，778 号；Bird，Science (1988) 242 :423-426 ；Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 :5879-5883 ；和 Ward 等人，Nature (1989) 334 :544-546)。用于抗体产生的其他适宜的技术包括将淋巴细胞体外暴露于抗原性多肽或可选地在噬菌体或相似的载体中进行抗体文库的选择(Huse等人，Science (1989) 246 1275-1281)。可使用现有的claspin抗体，且其对于本领域技术人员是已知的。所述抗体的例子为，例如，目录号 A300-266A、A300-265A、A300-267A 和 BP300-266，均来自 Bethyl Laboratories, Inc. (Texas, USA)。本发明的多肽和抗体可在修饰或不修饰的情况下使用。通常，通过与提供可检测信号的物质或对表达靶蛋白的细胞具有毒性的物质的共价结合或非共价结合来标记抗体 (Menard S，等人，Int J.Biol Markers (1989) 4 131-134)。多种标记物和轭合技术是已知的，且广泛记录于科学文献和专利文献中。适宜的标记物包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、荧光发射镧系金属、化学发光部分、生物发光部分、磁性颗粒和类似物(美国专利第3，817，837号 ’第3，850，752号 ’第3，939，350号 ’第3，996，345号 ’第 4，277，437号；第4，275，149号；和第4，366，241号)。而且，可产生重组的免疫球蛋白(美国专利第4，816，567号)。通过与膜穿透毒蛋白轭合可递送胞质多肽的抗体并使其到达它们的靶标(美国专利第6，086，900号)。当在患者中用于治疗性应用时，本发明的抗体通常经胃肠外施用，或当靶标位点处可能时进行静脉内施用。通过临床研究来决定治疗有效剂量和剂量方案。通常，施用的抗体的量在约0. lmg/kg患者体重至约10mg/kg患者体重的范围内。对于胃肠外施用，抗体与药学上可接受的运载体一起被配制为单位剂量可注射形式(例如，溶液、悬浮液、乳液)。 所述运载体是固有地非毒性的和非治疗性的。例子是水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和 5%的人血清白蛋白。还可使用非水运载体比如非挥发油、油酸乙酯或脂质体载体。运载体可含有较少量的添加剂，比如缓冲剂和防腐剂，其增强等渗性和化学稳定性或以其他方式增强治疗效力。所述运载体中的抗体浓度通常在约lmg/ml至约10mg/ml的范围内。免疫治疗方法在文献中被进一步描述(美国专利第5，859，206号；W00073469)。其他优选的claspin-调节剂包括核酸分子，比如反义寡聚物或双链RNA(dsRNA)， 其一般抑制claspin活性。优选的核酸调节剂干扰claspin核酸的功能，所述claspin核酸的功能比如DNA复制、转录、claspin RNA转位到蛋白翻译位点、从claspin RNA进行蛋白翻译、claspin RNA剪接以产生一种或多种mRNA物质，或claspin RNA可能参与的或通过claspin RNA来促进的催化活性。在一个实施方案中，反义寡聚物是与claspin mRNA充分互补以结合和阻止翻译， 优选地通过与5'非翻译区结合。Claspin特异性的反义寡核苷酸，优选地范围从至少6个核苷酸至约200个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸优选地为至少10个、15个或20个核苷酸长度。在另外的实施方案中，寡核苷酸优选地小于50个、40个或30个核苷酸长度。 寡核苷酸可以是单链的或双链的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修饰的形式。可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上对寡核苷酸进行修饰。寡核苷酸可包括另外的附加基团，比如肽、有利于运输跨越细胞膜的剂、杂交触发裂解剂和嵌入剂。在本发明的一个实施方案中，SiNA分子包括反义链，所述反义链包括与编码 claspin蛋白的mRNA序列或其部分互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，claspin siNA构建体的反义区包括与具有SEQ ID NO. 1、3、5 和7中的任一个的序列互补的序列。在一个实施方案中，claspin构建体的反义区包括具有 SEQ ID NO. 2、4、6、8、9、10、11、12 和 13 中任一个的序列。在本发明的一个实施方案中，提供RNA，所述RNA包括SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、 11、12或13的序列，或由SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12或13的序列组成，或基本上由 SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12 或 13 的序列组成。优选地，序列是 SEQ ID N0:9、10、ll、 12或13其中之一。在一些实施方案中，可提供相对于SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12或13具有不同的碱基取代、添加或缺失的序列。优选地，任何取代、添加或缺失将不会使RNA作为针对 claspin mRNA的反义分子的功能受到显著损害。优选地，被添加、缺失或取代的碱基的数目将仅约为1个、2个或3个碱基。如以下更详细地描述的，在不同的严格度下，经由例如杂交检验可检验反义分子保持为可行的反义分子的能力。在另一个实施方案中，反义寡聚物是硫代磷酸吗啉代寡聚物(PMO)。PMO由四种不同的吗啉代亚基组装，其中每一个含有与六元吗啉环连接的四个遗传碱基(A、C、G或T)之一。这些亚基的聚合物通过非离子磷酰二胺亚基间的键而结合。如何制备和使用PMO和其他反义寡聚物的细节是本领域中熟知的(例如，参见W099/18193 ；Probst JC, Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design(反义寡脱氧核苷酸禾口核酶设计)，Methods. (2000)22(3) :271-281 ；Summerton J 禾口 Weller D.1997 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7 :187-95 ；美国专利第5，235，033号；和美国专利第5，378，841号)。可选的优选的claspin核酸调节剂是介导RNA干扰(RNAi)的双链RNA物质。 RNAi是动物和植物中通过与沉默的基因序列同源的双链RNA(dsRNA)起始的序列特异性的、转录后基因沉默的过程。有关RNAi在秀丽线虫(C. elegans)、果蝇(Drosophila)、 植物和人类中用于使基因沉默的用途的方法是本领域中已知的(Fire A，等人，1998 Nature 391 :806-811 ；Fire, A. Trends Genet. 15，358-363(1999) ；Sharp, P. A. RNA interference 2001(RNA 干扰 2001) · Genes Dev.15,485-490(2001) ；Hammond, S. Μ·，等人，Nature Rev. Genet. 2,110-1119 (2001) ；Tuschl, Τ. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001)； Hamilton, Α.等人，Science 286,950-952(1999) ；Hammond, S. Μ.,等人，Nature 404, 293-296(2000) ；Zamore，P. D.，等人，Cell 101，25-33 (2000) ；Bernstein，Ε·，等人，Nature 409,363-366(2001) ；Elbashir, S. Μ·，等人，Genes Dev. 15,188-200(2001) ；W00129058 ； W09932619 ；Elbashir SM，等人，2001 Nature 411 :494-498 ；Novina CD 和 Sharp P. 2004 Nature 430 :161-164 ；Soutschek J 等人 2004 Nature 432:173-178)。在本发明的一个实施方案中，SiNA分子包括反义链，所述反义链包括与编码 claspin蛋白的mRNA序列或其部分互补的核苷酸序列。任选地，siNA还包括有义链，其中所述有义链与所述反义链互补。在一个实施方案中，claspin siNA构建体的反义区包括与具有SEQ ID NO. 1、3、5 和7中的任一个的序列互补的序列。在一个实施方案中，claspin构建体的反义区包括具有SEQ ID N0. 2、4、6、8、9、10、11、12和13中的任一个的序列。在另一个实施方案中，其中提供siNA双链体，claspin构建体的有义区包括具有SEQ ID NO. 1、3、5、7中的任一个的序列和与SEQ ID NO :9-13互补的序列。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括SEQ ID N0. 1-13中的任一个。在一个实施方案中，本发明的siNA分子包括SEQ ID N0. 1_13中的任一个，优选地为包括 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和互补序列、SEQ ID NO 10 和互补序列、SEQ ID NO 11和互补序列、SEQ ID NO 12和互补序列、SEQ ID N0:13和互补序列的
双链体。在本发明的一个实施方案中，提供RNA，所述RNA包括SEQ ID NO :9、10、11、12或 13的序列、或由SEQ ID NO :9、10、11、12或13的序列组成，或基本上由SEQ ID NO :9,10, 11、12或13的序列组成。在一些实施方案中，包括SEQ ID NO :9、10、11、12或13的序列还将包括导致RNA双链体形成的基本上互补的序列。所述双链体可用于claspin表达的RNA 干扰。技术人员将知道对于SEQ ID N0:9、10、ll、12和13的适当的互补序列。
核酸调节剂常用作研究试剂、诊断剂和治疗剂。例如，反义寡核苷酸，其能够以精确的特异性抑制基因表达，常用于阐明特定基因的功能(参见，例如，美国专利第 6，165，790号)。核酸调节剂还用于，例如，区分生物途径的不同成员的功能。例如，反义寡聚物已用作动物和人类中治疗疾病状况的治疗性部分，并在大量临床试验中已被证明是安全禾口有效的(Milligan JF，等人，Current Concepts in Antisense Drug Design (现代反义药物设计概念)，J Med Chem. (1993)36 :1923-1937 ；Tonkinson JL 等人，Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents (反义寡脱氧核苷酸作为临床治疗剂)，Cancer Invest. (1996) 14:54-65)。因此，在本发明的一方面，claspin特异性的核酸调节剂用于测定以进一步阐明claspin与BRCAl的作用。在本发明的另一方面， claspin特异性的反义寡聚物用作用于治疗BRCA相关的疾病状况的治疗剂。优选的claspin核苷酸调节剂是具有能够干扰claspin的功能(例如，活性和/或表达)的序列的siRNA抑制剂。例如，将SEQ ID NO 1_13中显示的序列用来抑制claspin。 优选地，将包括 SEQ ID NO IfPSEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 9 和互补序列，SEQ ID NO 10 和互补序列、SEQ ID NO :11和互补序列、SEQ ID NO 12和互补序列、以及SEQ ID NO: 13禾口互补序列的双链体用来抑制claspin。优选地，使用许多不同的双链体(例如，2个、3个或 4个双链体)的混合物。优选地，还可使用分别包括SEQ ID NO :9、10、11、12和13的双链体，以及包括SEQ ID NO :9、10、11、12和13的单链。现将仅以举例的方式参照附图描述本发明的实施方案，其中

图1显示Claspin对响应于复制压力的细胞反应的作用。(A)以对照或Claspin siRNA转染HeLa细胞。48小时之后裂解细胞并利用指定的抗体使细胞经受免疫印迹。(B) 利用Claspin或对照siRNA转染细胞48小时，然后用新鲜培养基或含有2mM HU的培养基 (HU)再处理M小时。随后将细胞在含有BrdU的培养基中孵育30分钟，收获并处理以用于通过荧光激活细胞分选进行分析。(C)裂解如以上(B)中被转染的细胞并利用指定的抗体进行免疫印迹(上图)。利用Image J软件对印迹数据进行定量，并将Chkl激活的程度 (如通过P4er345和Pler 317染色的强度所测量的)表示为总Chkl蛋白(深色柱)或总肌动蛋白(浅色柱)的比例。图2显示Chkl与BRCAl以及Claspin —起形成体内稳定的复合物。利用2mM HU 处理HeLa细胞M小时，然后进行裂解。以抗Chkl抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，且将免疫沉淀物进行电泳，然后以指定的抗体进行免疫印迹。图3显示BRCAl-缺陷的HCC1937细胞中Claspin的消除导致了不能稳定暴露于外源施加的复制压力的复制体。(A)以对照或Claspin siRNA转染HCC1937细胞。48小时之后裂解细胞并以指定的抗体使其经受免疫印迹。(B)用Claspin siRNA或对照siRNA转染细胞48小时，然后用新鲜培养基或含有2mM HU的培养基(HU)再处理M小时。随后在含有BrdU的培养基中孵育细胞30分钟，收获并处理细胞以用于通过荧光激活细胞分选进行分析。(C)将如以上(B)中转染的细胞进行裂解并用指定的抗体进行免疫印迹(上图)。 利用Image J软件对印迹数据进行定量，并将Chkl激活的程度(如通过P4er345和Pler 317染色的强度所测量的)表示为总Chkl蛋白(深色柱)或总肌动蛋白(浅色柱)的比例。
图4显示HCC1937细胞中claspin消除诱导的S期能力的丢失增加导致了对生长的显著影响。用对照siRNA或Claspin siRNA处理HeLa细胞(A)或HCC1937细胞(B)，然后如针对图1的图例中所描述的暴露于HU M小时。然后将细胞在含有BrdU的培养基中孵育 30分钟，然后进行二变量FACS处理。在每种情况中，绘制了不能掺入显著水平的BrdU(如由每个插图中的矩形指示)的S期细胞的比例。(C、D)用对照siRNA或Claspin siRNA处理HeLa细胞(C)或HCC1937细胞(D) 48小时，然后重新接种到新鲜培养基中。在指定的时间确定细胞数目并将其表示为初始数目的比例。图5显示人类Claspin的基因结构，显示选择用于siRNA产生的序列的位置和本研究中所用的单独siRNA的序列。图6显示蛋白质印迹，显示用以下处理的UWB1. 289+BRCA1 (WCE)细胞中Claspin 的表达:a)用非靶向 siRNA 处理，b)用 30nM Claspin siRNA(Seq ID No 13)处理，c)用 IOOnM Claspin siRNA 处理(kq ID No 13)，d)用 300nM Claspin siRNA (Seq ID no 13)处理。图7显示子宫颈癌细胞系的典型的双变量FACS分析的结果，针对DNA含量绘制 BrdU掺入。Gl期、S期和G2/M期的细胞由红色矩形所指示。复制失败导致细胞出现在感兴趣的区域(RoI)中。图8显示(BRCA1+/+)子宫颈癌细胞系(A和B，左图)和(BRCA1-/—)乳腺癌细胞系(A和B，右图)的双变量FACS分析的结果，针对DNA含量绘制BrdU掺入。Gl期、S期和 G2/M期的细胞由红色矩形所指示。复制失败导致细胞出现在感兴趣的区域(RoI)中。图9显示来源于图8中所示的数据的图，该图显示用Claspin siRNA (Seq ID No 9-13)或非靶向siRNA处理的BRCAl+/+(灰条)和BRCA-/-细胞(黑条)中未标记的S期细胞的比例。本发明提供鉴定作为可用于治疗与缺陷型BRCA(例如，BRCAl或BRCA2)基因相关的疾患的候选治疗剂的claspin调节剂的方法。优选的claspin调节剂可特异性地结合 claspin多肽并抑制claspin功能。其他优选的claspin调节剂是能够通过例如与相应的核酸(即，mRNA或DNA)结合并抑制相应的核酸来抑制claspin基因表达或产物活性的核酸调节剂，比如干扰RNA(RNAi)和反义寡聚物。并且，如本文所用的，claspin调节剂可以是调节参与DNA复制过程的Claspin依赖性控制的下游组分的剂。可通过任何便利的体外测定或体内测定评估Claspin调节剂与claspin多肽或核酸的分子相互作用。在一个实施方案中，用包括claspin多肽或核酸的测定系统检验候选 claspin调节剂。将相对于对照产生测定系统的活性的改变的剂鉴定为候选的claspin调节剂。测定系统可以是基于细胞的系统或无细胞的系统。Claspin调节剂包括claspin相关蛋白(例如，显性负突变体和生物治疗剂)；claspin特异性抗体；claspin特异性反义寡聚物和另外的核酸调节剂；和与claspin特异性结合或与claspin相互作用的或与claspin 结合伴侣竞争(例如，通过与claspin结合伴侣结合)的化学剂。本发明还提供通过将(哺乳动物)细胞与特异性结合claspin多肽或核酸的剂接触而调节细胞(优选地为哺乳动物细胞)中claspin功能的方法。所述剂可以是小分子调节剂、核酸调节剂或抗体，且可被施用于预先确定患有与BRCA基因相关的病理学的动物 (哺乳动物)。
本发明提供鉴定与claspin相互作用和/或调节claspin的功能的剂的方法。通过所述方法鉴定的调节剂也是本发明的部分。所述剂可用于与BRCA基因缺陷有关的多种诊断应用和治疗应用中，以及用于claspin蛋白和其对于治疗BRCA相关疾病的作用的进一步分析中。因此，本发明还提供调节细胞生存力的方法，所述方法包括通过施用claspin相互作用剂或claspin调节剂而特异性地调节claspin活性的步骤。本发明提供用于鉴定claspin活性的特异性调节剂的测定系统和筛选方法。如本文所用的，“测定系统”包括进行检测和/或测量特定事件的测定和分析所述测定的结果所需的所有组分。一般地，初始测定被用来鉴定或确定调节剂与claspin核酸或蛋白相关的特异的生物化学作用或分子作用。在一个优选的实施方案中，筛选方法包括将包括claspin多肽或核酸的适宜的测定系统与候选剂在如果没有剂的存在，系统提供基于筛选方法检测的特定分子事件的参考活性的条件下接触。剂偏置的(agent-biased)活性和参考活性之间的统计学显著性差异表明候选剂调节claspin活性。用于测定中的claspin多肽或核酸可包括以上所描述的核酸或多肽中的任一。特异性claspin调节剂可用于多种诊断应用和治疗应用中，其中疾病或疾病预后与BRCA缺陷有关，比如血管生成疾患、细胞凋亡疾患或细胞增殖疾患。本发明还提供通过施用治疗有效量的与抗肿瘤剂组合的claspin调节剂而治疗与受损的BRCA功能有关的疾患或疾病的方法。本发明还提供通过施用claspin调节剂以调节细胞中claspin功能的方法，所述细胞优选地为预先确定具有缺陷型BRCA功能或受损的BRCA功能的细胞。此外，本发明提供通过施用治疗有效量的claspin调节剂来治疗与受损的BRCA功能相关的疾患或疾病的方法。本发明包括用于在哺乳动物中治疗异常细胞生长的药物组合物，所述哺乳动物包括人类。在一个实施方案中，异常细胞生长是癌症，尤其是包括具有BRCA缺陷的恶性细胞的癌症。如本文所用的，除非另外指明，术语“癌症”指特征为失控的、异常的细胞生长和/ 或增殖的疾病。在本发明的一方面，癌症包括实体瘤，包括但不限于，转移性实体瘤。在一方面，实体瘤是内皮细胞癌，包括但不限于，肾细胞癌、结肠癌、移行细胞癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌。肾细胞癌的例子包括但不限于，透明细胞癌、乳头状癌、嫌色细胞癌、集合管癌和未分类的癌。肺癌的例子包括但不限于，腺癌、肺泡细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和小细胞癌。乳腺癌的例子包括但不限于，腺癌、原位导管癌、原位小叶癌、浸润性导管癌、髓样癌和黏液癌。在本发明的另一方面，实体瘤是内皮细胞肉瘤，包括但不限于，软组织肉瘤。在某些实施方案中，癌性病症或恶性病症可包括选自包括但不限于以下的组的病症恶性黑色素瘤、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、 结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌和非霍奇金淋巴瘤。如本文所用的，术语“化学治疗剂”、“抗肿瘤剂”、“细胞毒性剂，，互换地使用，且除另外指明外，指用于治疗癌症的任何剂，其抑制、破坏、阻止或干扰异常细胞生长和/或增殖。化学治疗剂的例子包括但不限于，诱导凋亡的剂、烷化剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、植物生物碱、嵌入性抗生素、芳香酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、细
22胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂、类固醇激素和抗雄激素。在一些实施方案中，单克隆抗体可与单一种类的化学治疗剂组合，而在另外的实施方案中，其可与多种种类的化学治疗剂组合。烷化剂的例子包括但不限于，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(Iomustine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥和链脲菌素。抗生素的例子包括但不限于，亚德利亚霉素、博莱霉素、更生霉素、道诺霉素、多柔比星(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)和普卡霉素。 抗代谢物的例子包括但不限于，阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabine)、5_氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、6-硫鸟嘌呤。有丝分裂抑制剂的例子包括但不限于，诺维本(navelbine)、 紫杉醇、长春花碱和长春新碱。类固醇激素和抗雄激素的例子包括但不限于，氨鲁米特 (aminoglutethimide)、雌激素、氟他胺(flutamide)、戈舍瑞林(goserelin)、亮丙立德 (Ieuprolide)、强的丰公(prednisone)禾口他莫昔芬(tamoxifen)。在本发明的一些实施方案中，细胞毒性剂选自由细胞毒素、化学治疗剂和放射物组成的组。细胞毒素的例子包括但不限于，白树毒素、蓖麻毒蛋白、皂苷、假单胞菌外毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素、和补体蛋白。化学治疗剂的例子包括但不限于，烷化剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、植物生物碱、嵌入性抗生素、芳香酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节齐U、抗激素和抗雄激素。化学治疗剂的另外的例子包括但不限于BCNU、顺钼、吉西他滨 (gemcitabine)、羟基脲、紫杉醇、替莫唑胺(temozomide)、托泊替康(topotecan)、氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱、丙卡巴胼、达卡巴嗪、六甲基蜜胺、顺钼、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、阿扎胞苷、长春花碱、长春新碱、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、紫杉萜、多柔比星、道诺霉素、更生霉素、伊达比星(idarubicin)、普卡霉素、亚德利亚霉素、丝裂霉素、博莱霉素、他莫昔芬、氟他胺、亮丙立德、戈舍瑞林、氨鲁米特、阿那曲唑(anastrozole)、安吖啶、天冬酰胺酶、米托蒽醌、米托坦和氨磷汀。在其中细胞毒性剂是放射物的另一个实施方案中，放射物是放射性同位素。放射性同位素的例子包括，但不限于，3H、14C、18F、19F、31P、32P、35S、131I、125I、123I、64CU、1OTRe、mIn、 9°Y、99mTc、mLu。在一个实施方案中，放射性同位素通过α-(5-异硫氰酰-2-甲氧苯基)_1， 4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(甲氧基-D0TA)与抗体连接。放射物的另一个例子是外线束放射物。以上化学治疗剂的药物制剂的例子包括但不限于，BCNU (即，卡莫司汀，1，3_双 (2-氯乙基)-1-硝基脲，BiCNU )、顺钼(顺钼，顺二氯化二氨亚钼，Platinol )、多柔比星(羟基道诺霉素，Adriamycin )、吉西他滨(二氟代脱氧胞唆，Gemzar )、羟基脲(羟基尿素，Hydrea )、紫杉醇(Taxol )、替莫唑胺(TMZ，Temodar )、托泊替康 (Hycamtin )、氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶，5-FU，Adrucil )、长春新碱(VCR,Oncovin )和长春花碱(Vdbe 或Vdban )。本发明的药物组合物可经由胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮或口腔路径来施用。例如，可经由微注射将剂局部施用至肿瘤。可选地，或同时地，可通过口腔路径来使用。例如，可将化学治疗剂局部施用至肿瘤的位点，然后口腔施用至少一种调节claspin 的剂。该过程可逆序进行(例如，将claspin调节剂局部施用至肿瘤的位点，同时例如静脉内施用治疗剂)。在化学治疗剂之后或之前施用claspin调节剂可具有在为了成功结果的随后治疗中减少必需的化学治疗剂的量的作用，从而减少了化学治疗剂带来的严重的副作用。所施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率、和期望的作用的性质。此外，本发明的组合物可含有适宜的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括赋形剂和助剂，所述赋形剂和助剂促进将活性化合物加工成用于递送到作用位点的可用于药物使用的制剂。用于胃肠外施用的适宜的制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性盐。此外，可施用作为适当的油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。 适宜的亲脂性溶剂或运载体包括脂肪油，例如，芝麻油或合成脂肪酸酯，例如，油酸乙酯或甘油三酯。含水注射悬浮液可含有提高悬浮液的粘度的物质，包括，例如，羧甲基纤维素钠、 山梨糖醇和葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有稳定剂。脂质体还可用来封装所述剂以用于递送到细胞中。可配制根据本发明的用于系统施用的药物制剂以用于肠内施用、胃肠外施用或局部施用。事实上，可同时使用所有三种类型的制剂以实现活性成分的系统施用。如以上所提到的，可使用局部施用。可应用任何常见的局部制剂比如溶液、悬浮液、凝胶、软膏或油膏和类似的局部制剂。药物制剂的领域中描述了所述局部制剂的制备， 如例如通过 Gennaro 等人(1995) Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学)，Mack Publishing所示例的。为进行局部施用，还可将组合物作为粉末或喷雾来施用，尤其以气溶胶的形式。在一些实施方案中，本发明的组合物可通过吸入来施用。对于吸入疗法，活性成分可以以用于通过计量的剂量吸入器来施用的溶液，或以适宜于干粉吸入器的形式。在另一个实施方案中，组合物适宜于通过支气管灌洗来施用。用于口腔施用的适宜的制剂包括硬的或软的明胶胶囊、丸剂、片剂，包括包衣片齐U、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入物和其控释形式。在另一个实施方案中，药物组合物包括与至少一种细胞毒性剂组合的Claspin调节剂，其中所述调节剂或剂为持续释放的形式。在所述制剂中，在细胞毒性剂释放之前或在细胞毒性剂释放之后，claspin调节剂可分布遍及身体。在一个实施方案中，当claspin调节剂从所述制剂中延迟释放并随后分布至癌细胞的位点后，调节剂的作用可通过细胞毒性剂对癌细胞先前的结合或作用来增强。所述延迟释放的制剂可具有与一种或多种细胞毒性剂之后施用claspin调节剂或相反顺序的顺序施用相同的作用。如本文所用的，除非另外指明，术语“药学上可接受的”意为由管理机构批准用于动物且更具体地用于人类。术语“运载体”指利用其施用本发明的化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂、或载体。所述药物运载体可以是，例如，液体，比如水和油，包括石油来源、动物来源、 植物来源或合成来源的那些油，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似的油。药物运载体可以是盐水、甲基纤维素、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、尿素和类似物。此外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当向患者施用时，本发明的组合物和药学上可接受的运载体优选地是无菌的。当本发明的组合物经静脉内施用时， 水是优选的运载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体运载体，尤其用于可注射溶液。适宜的药物运载体还包括赋形剂，比如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇和类似的赋形剂。如果需要的话，本组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂，或 PH缓冲剂。如本文所用的，除非另外指明，短语“药学上可接受的盐”包括但不限于，可存在于组合物中的酸性基团或碱性基团的盐。包括于本组合物中的碱性性质的多肽能够与不同的无机酸和有机酸形成多种盐类。可用来制备此类碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成非毒性酸加成盐的那些(即，含有药理学上可接受的阴离子的盐)，包括， 但不限于，硫酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、乙酸盐、草酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、重硫酸盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、 马来酸盐、gentisinate、延胡索酸盐、葡糖酸盐、glucaronate、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1，1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸)盐。包括在用于本发明的方法的组合物中的酸性性质的多肽能够与不同的药理学上可接受的阳离子形成碱盐。所述盐的例子包括碱金属盐或碱土金属盐，和特别地为，钙盐、镁盐、钠盐、锂盐、锌盐、钾盐和铁盐。如本文所用的，除非另外指明，术语“治疗有效的”指能够导致疾病或疾患的改善、 或疾病或疾患的至少一种可辨别的症状的改善的claspin调节剂和/或细胞毒性剂或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物的量。“治疗有效的”还指导致至少一种可测量的生理参数的改善，而不必是患者可辨别的改善的量。在又一个实施方案中，术语“治疗有效的”指在身体方面(例如，可辨别症状的稳定)、生理方面(例如，生理参数的稳定)或两方面抑制疾病或疾患的进程的量。在又一个另外的实施方案中，术语“治疗有效的”指导致疾病或疾患延迟发作的量。如本文所用的，除非另外指明，术语“预防有效的”指导致获得给定的疾病或疾患的风险降低的claspin调节剂、细胞毒性剂或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物的量。在一个实施方案中，组合物作为预防性方法施用给对于本文所描述的疾患具有遗传易患性的动物，优选地为人。在本发明的另一个实施方案中，将组合物作为预防性方法施用给对本文所描述的疾患具有非遗传易患性的患者。本发明的组合物还可用来预防一种疾病或疾患并同时治疗另一种。本发明包括用于在包括人类的哺乳动物中治疗癌症的方法。所述方法包括治疗或抑制癌细胞的异常生长和/或增殖，所述癌细胞包括肿瘤性疾病的恶性细胞。异常的细胞生长的抑制可通过多种机制来发生，包括但不限于，凋亡、细胞死亡、细胞分裂、转录、翻译、 转导的抑制，等等。如以上所讨论的，claspin调节剂可与用于治疗癌症的细胞毒性剂组合提供或顺序组合提供。如本文所用的，当两种剂同时施用或以使得两种剂以累加的方式或协同的方式发挥作用的方式独立地施用时，称两种剂为组合施用。例如，可将claspin调节剂与选自以下类型的化学治疗剂的一种或多种化学治疗剂组合使用，所述化学治疗剂包括但不限于，如本文以上所描述的凋亡剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入性抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂、抗激素和抗雄激素。在实践本发明的方法时，可单独使用claspin调节剂或将claspin调节剂与另外的治疗剂或诊断剂组合使用。在某些优选的实施方案中，claspin调节剂可与根据普遍公认的肿瘤学医学实践通常为多种类型的癌症开处方的另外的化学治疗剂共施用。本发明的组合物可用于体内，通常用于哺乳动物中，比如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠中， 或体外使用。本发明尤其可用于治疗人类受治疗者。共施用可以是独立的、顺序的或复合的。因此，claspin调节剂可以在抗肿瘤剂之前或之后独立地施用。如果在抗肿瘤剂之前施用claspin调节剂，这可能是有利的，因为其可“引发”细胞对抗肿瘤剂更敏感。因此可能减少获得治疗效果需要的抗肿瘤剂的剂量，其对于患者的良好状态是有利的，因为可能降低了抗肿瘤剂的副作用。相反地，如果在 claspin调节剂之前施用抗肿瘤剂，则细胞可能对claspin调节剂更顺从，导致更快的杀伤时间(kill-time)。可选地，共施用可组合为一种药物制剂或同时服用的两种独立的制剂。在本发明的特定的实施方案中，提供抗claspin的siRNA分子和靶向DNA复制的齐 的组合，比如如以上所讨论的抗癌剂，例如，化学治疗剂或细胞毒性剂。任何抗claspin的RNA分子可以是适宜的，且可由本领域技术人员利用熟知的技术容易地构建，例如，确定claspin基因中的特定的序列，和构建针对由上述DNA序列产生的mRNA的适当的反义分子。特别地，提供包括SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 和 13 中的一种或多种的RNA分子与抗癌剂的组合，优选地为SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10、11、12和13与抗癌剂的组合。并且，提供包括 SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 禾口 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 和互补序列、SEQ ID NO 10和互补序列、SEQ ID NO 11和互补序列、SEQ ID NO 12和互补序列、以及SEQ ID NO: 13和互补序列的RNA双链体与抗癌剂的组合。优选地，siRNA分子和抗复制剂的组合用于治疗增殖性疾病诸如由BRCAl基因或 BRCA2基因的缺陷导致的癌症。如以上所讨论的，所述组合治疗可以是其中siRNA在抗复制剂之前施用、与抗复制剂同时施用或在抗复制剂之后施用的组合治疗。许多所谓的衔接蛋白(adaptor protein)已参与对于复制压力的细胞反应，且推测其作用于上游或直接作用以促进Chkl途径的激活。本发明人先前已证明，Chkl是S-期内部复制体稳定性检验点的信号传递组分，其确保了感知停滞复制叉和电离辐射诱导的双链断裂的途径，且Chki的一个功能是当从S期中早期启动的起点的合成被抑制时，确保晚期启动复制起点的激活被阻遏。Claspin最初在爪蟾卵提取物中被鉴定为Chkl结合蛋白， 其是Chkl被ATR磷酸化和激活所需的。本发明人已研究了在施加复制压力之后Claspin 在维持复制体稳定性中的作用。为研究Claspin在复制体稳定性检验点中的作用，使用siRNA(参见SEQ ID NO 1-13)禾Π siRNA双链体(例如，SEQ ID NO :1禾Π 2 ；3和4 ;5禾Π 6 ；7和8等等)从HeLa细胞消除 Claspin。用特异性siRNA处理HeLa细胞导致48小时之后与暴露于对照siRNA(例如，荧光素酶，其在这些细胞中不表达)的细胞相比> 90%的Claspin的消除(图1A)。为评估 Claspin消除对复制体稳定性的作用，研究了在施加的复制压力持续存在下Claspin消除的细胞维持功能性复制体的能力(图1)。为进行研究，用缓冲液对照或2mM羟基脲(HU)处理细胞M小时，然后暴露于30分钟BrdU脉冲标记，然后进行固定和PI染色，和随后进行双变量FACS分析。在不存在任何施加的复制压力时，Claspin的消除对未进行其他处理的细胞经历S期(图1B，左图)或度过细胞周期(图1B，右图)的能力具有很小影响或无影响。细胞暴露于羟基脲M小时导致如预期的细胞在S期早期的显著累积(图1B)。有趣地是，Claspin消除的细胞能够以与在未处理的细胞中获得的相当的速率掺入BrdU，表明即使在暴露于HU 24小时之后，单独的Claspin的不存在对功能性复制叉的数目基本上无影响(图1 。这些数据表明在Claspin几乎完全不存在时，复制体稳定性检验点保持完整。与此观察结果一致地是，本发明人已发现如通过Chkl在ser317和ser345的磷酸化程度所测量的，表示为总Chkl的量的比例或每细胞激活的Chkl的量，经由Chkl的信号传递仅受到 Claspin不存在的轻微的影响(20-40% )(图1C)。为确定是否任何其他衔接蛋白在该检验点中具有作用，本发明人首先试图通过免疫共沉淀来确定哪种已知衔接蛋白可发现于与Chkl的稳定复合物中。许多研究已表明在转染并过表达加标签的蛋白的细胞中所述复合物的存在；本发明人试图研究未转染的细胞中内源性复合物的存在。将Chkl从不同步生长的细胞或HU处理的细胞共沉淀，且探测共沉淀物中参与DNA损伤反应的多个方面中的衔接蛋白的存在。如所预期的，在ChklIP中能检测到Claspin (图2)。有趣地是，HU处理的细胞中Chkl相关的Claspin的量显著提高了。本发明人还在Chkl免疫沉淀物中发现BRCA1，虽然BRCAl的水平未受HU处理的影响。 在Chkl免疫沉淀物中未检测到其他BRCT结构域包含蛋白诸如MDCl或TopBPl (图2)。先前已显示BRCAl参与对于顶的细胞反应，且BRCAl缺陷的细胞在顶暴露后不能激活Chkl。本发明人研究了 HCC1937细胞中siRNA介导的Claspin的敲低的作用，所述 HCC1937细胞缺少功能性的BRCA1，且先前显示其具有缺陷型的G2检验点，在暴露于顶后不能停滞。用Claspin siRNA处理HCC1937细胞一致地导致Claspin的> 90%的丢失(图 3A)。有趣地是，如通过FACS所分析的，Claspin的另外丢失导致了 G2细胞的少许增加(图 3B)，表明这些细胞即使在不存在任何外源压力的情况下经历了 G2的少许延迟。将模拟物 siRNA处理的HCC1937细胞暴露于羟基脲导致了如预期的S期早期的细胞的累积(图。 重要地是，HCC1937细胞即使在暴露于HU M小时之后仍能够较大程度地掺入BrdU，表明即使在暴露于HU M小时之后，BRCAl的不存在也对功能性复制叉的数目基本上没有影响。与此鲜明对比地，HCC1937细胞中Claspin的消除导致暴露于HU的细胞的双变量FACS谱的显著改变(图3B，左图)，具有显著比例的不能掺入BrdU的S期细胞。在S期中期至晚期的细胞中尤其观察到了 BrdU掺入的丢失。本发明人先前已显示，去除Chkl功能导致哺乳动物细胞中调节复制体稳定性和起点启动的S期内部检验点的丢失。如通过由免疫印迹所确定的Chk 1在S er317和 ser345处的磷酸化程度所测量的，确定了暴露于HU的模拟物siRNA处理的HCC1937细胞和 Claspin siRNA处理的HCC1937细胞中Chkl的激活状态(图3C)。发现在模拟物siRNA处理的细胞中，暴露于HU M小时导致了 Chkl的显著激活(图3C)，且Chkl的磷酸化程度与含野生型BRCAl的细胞中所观察的相当(图1)。有趣地是，当表示为总Chkl蛋白的比例时，HCC1937细胞中Claspin的消除导致了与缺少单独Claspin的细胞中所观察到的(图 1)相似的磷酸化Chkl的减少(图3C)。然而，Claspin和BRCAl功能缺失的组合导致了每细胞激活的Chkl的水平的显著减少(> 75% )(图3C)。
总之，图1-4中的数据表明在施加的复制压力的条件下，BRCAl和Claspin协调作用维持复制体的稳定性，且表明它们通过激活Chkl蛋白激酶来进行所述协调作用。因为认为所有细胞在经过S期的正常进程过程中经历某些复制压力，所以可能地是BRCAl和Claspin两者的丢失将导致S期过程中复制体不稳定性的显著水平，导致基因组的不完全复制。因此本发明人研究了 BRCAl和Claspin功能的组合缺失对细胞增殖的重要性。为进行该研究，将HeLa细胞或HCC1937细胞暴露于如先前所描述的对照siRNA或 Claspin siRNA，且在正常培养条件下对细胞进行铺板，并在随后的时间确定细胞数目。已知HCC1937细胞具有 30小时的倍增时间，且因此增殖显著慢于HeLa细胞(图4A和B)。 将HeLa细胞暴露于Claspin siRNA导致了生长特性的轻微降低，且在96小时培养之后，相对于对照siRNA处理的细胞的18倍群体增加具有12倍的增加。模拟物处理的HCC1937细胞在相同的时间段显示了近3倍的群体增加。有趣地是，缺少Claspin的HCC1937细胞没有显示出任何显著的增殖，且净细胞数目甚至在96小时之后保持不变。这些数据表明功能性BRCAl或Claspin的存在对于细胞生存力是足够的。然而，缺少两种基因的细胞不能增殖。该数据，连同先前公布的研究，表明在存在复制压力时BRCAl和Claspin与Chkl 在体内形成复合物，并协同作用以促进复制机器的稳定。此外，本发明人已发现虽然在HU 存在时Claspin的丢失降低了 Chkl变为磷酸化的Chkl的效率，BRCAl以及Claspin的缺少导致了降低的信号传递效率和降低的Chkl蛋白水平两者，导致了复制压力过程中有效的Chkl信号传递的显著降低。总之，结果与模型是一致的，在模型中BRCAl和Claspin协同作用以促进总细胞 Chkl蛋白的特定的亚级分的磷酸化和激活，当进行中的复制因为内源或外源施加的复制压力受到阻遏时，所述特定亚组分进而发挥作用以稳定复制机器的组分。稳定停滞的复制叉的机制以及Claspin和BRCAl促进细胞Chkl的特定级分的激活以引起其的进程仍未知。因为Chkl蛋白激酶在多个细胞周期检验点反应中具有作用，其已成为作为开发新颖抗癌治疗剂的潜在靶标而特别感兴趣的对象。已报道了 Chkl的一些有效的抑制剂(比如与它的ATP结合位点结合的UCN-01)。然而，它们缺少完整的特异性和具有显著的总体细胞毒性，使其在某种程度上不能成为先导化合物以用于新颖治疗应用。本文报道的结果提供开发用于个体的新型治疗剂的新机会，所述个体具有发生癌症诸如乳腺癌的遗传易患性。所述个体已遗传了 BRCAl或BRCA2的一个功能性形式和一个非功能性形式。在最终导致疾病的发作的转化过程中，出现了已丢失相关BRCA基因的第二个功能性形式的细胞。我们已发现乳腺癌细胞系HCC1937对抗肿瘤剂非常敏感，在所述细胞系中我们用实验方法去除了 Claspin功能且所述细胞系缺少BRCAl的两个拷贝，所述抗肿瘤剂比如暂时性干扰DNA复制(这是许多化学治疗剂干预的基础)的剂。数据表明，在该情况中，这些细胞是不能存活的，不能经历任何进一步的增殖并最终死亡。相比之下，保留Claspin或BRCAl的一个正常拷贝的细胞对所述处理相对不敏感。由此得出，例如，在遗传性乳腺癌患者中，预期包括与特定的Claspin抑制剂组合的抗肿瘤剂(比如，DNA复制的抑制剂)的药物“鸡尾酒(cocktail)”将通过选择性地阻遏缺少BRCAl的两个拷贝的那些细胞(即，肿瘤中)的增殖而同时对保留BRCAl基因的一个功能性拷贝的正常的周围乳房和其他组织具有极小影响而具有高治疗指数。实施例细胞培养将HeLa细胞或HEK293T细胞在37°C和5% CO2下维持在补充有10%胎牛血清的DMEM(Invitrogen)中。利用胰蛋白酶(Invitrogen)每7天两次将细胞以1传8传代以将细胞培养物维持在次最大汇合。将HCC1937细胞维持在补充有10%胎牛血清的 RPMI 1640 (http://www. atcc. org/Portals/l/Pdf/30-2001. pdf)中。利用胰蛋白酶 (Invitrogen)每7天两次将细胞以1传8进行传代以将细胞培养物维持在次最大汇合。通过细胞计数测定细胞增殖。将HeLa细胞或HCC1937细胞接种到60mm的组织培养平板中 (2 X IO5/平板)并放置 24 小时，然后用 OmM 或 2mM HU (Sigma-Aldrich，St Louise,MO, USA) 处理达96小时，且每M小时更换培养基。用500 μ L的胰蛋白酶对细胞进行胰酶消化，将细胞重悬于补充有5%胎牛血清的ImL PBS中并用血细胞计数器重复两次计数。瞬时转染将HeLa细胞或HCC1937细胞分别以5Χ IO4细胞或2X IO5细胞接种于6孔组织培养平板中的ImL的它们的培养基中并放置M小时。然后用温的PBS洗涤细胞两次，并在无血清培养基(OptiMEM(Invitrogen))中用IOOnM浓度的针对Claspin的SMARTpoolTM siRNA (Dharmacon, Chicago, IL, USA)根据生产商的说明利用 Oligofectamine Qnvitrogen) 转染细胞5小时，经48小时转染两次。每次转染之后，然后用温的PBS洗涤细胞一次，并添加1. 5mL的培养基，且然后放置19小时。转染之后，对细胞进行胰酶消化并将其接种于 60mm皿中且在新鲜培养基中放置M小时，然后用OmM或2mM HU处理M小时。可选地，不对细胞进行处理，将细胞在层流柜(flow cabinet)中放置相同的时间。处理之后，吸出培养基并用新鲜培养基再供给(re-fed)细胞，然后在37°C和5% CO2下再孵育1小时，然后收获细胞(参见以下)。细胞周期分析将亲本HeLa细胞或HCC1937细胞铺板到100_皿中(5 X IO5/平板)，且在M小时后用OmM或2mM HU处理M小时。在收获前30分钟，向培养基添加25 μ M BrdU(Sigma-Aldrich)。为进行收获，对细胞进行胰酶消化并在室温下以IOOOrpm离心5 分钟。然后去除上清液并将细胞重悬于IOmL IFA缓冲液(150mM Tris-HCl pH 7. 6、500mM NaCl.O. 5% NaN3>5% FCS)中。然后将细胞在1000rpm、4°C下再离心5分钟，然后在冰冷的PBS中洗涤两次，并用70% KOH(Sigma-Aldrich)进行固定。然后用1 50稀释的大鼠抗BrdU抗体(Abcam，Cambridge, UK)在4°C下染色细胞2小时，并用1 50稀释的辣根过氧化物酶连接的抗大鼠IgG在4°C下染色细胞1小时。随后用20μ g/mL的碘化丙啶 (Sigma-Aldrich)对细胞进行 DNA 染色，并用 200 μ g/mL 的 RNA 酶 A (Sigma-Aldrich)进行处理，然后在DAKO Cytometer FACS机器上进行分析。采集FACS文件并利用Summit v4. 3 进行测定。转染用siRNA处理的细胞并如以上所述进行处理，然后收获细胞以利用与用于亲代细胞系相同的方案进行FACS分析。此外，在通过FACS进行测定之前，通过免疫印迹测定siRNA转染的细胞的靶基因的siRNA敲低。免疫印迹和免疫沉淀将HeLa细胞或HCC1937细胞接种到IOOmrn的组织培养皿中(5X IO5/平板)并在37°C和5% CO2下放置M小时。然后用OmM或2mM HU处理细胞M小时，然后收获细胞。可选地，不对细胞进行处理(在层流柜中放置相同的时间)。将细胞在冰冷的PBS 中洗涤两次，然后在 IPLBQOmM Tris/醋酸盐 pH 7. 5、0. 27M 蔗糖、ImM EGTAUmM EDTA, ImM 原钒酸钠、IOmM β -磷酸甘油钠、5mM 焦磷酸钠、1 % (w/v) Triton X-100,0. 1% (ν/ν) β-巯基乙醇、ΙμΜ微囊藻毒素、0. 2mM PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche，Mannheim， GER))中，通过在冰上将细胞刮到Eppendorf管中收获细胞。然后通过3次冻/融循环裂解细胞，并通过在4°C下以14，OOOrpm离心5分钟使细胞澄清。然后去除上清液并通过Bradford测定(Pierce)测定浓度，并小份贮存于_70°C直至使用。为进行免疫印迹， 在Laemmli SDS上样缓冲液中每孔使用25-60 μ g的全细胞提取物。在6-12% SDS-PAGE 凝胶上分离提取物，然后转移到硝酸纤维素膜(Protran)上以进行探针检测。根据抗体生产商的指南，在5% Marvel奶粉或5% BSA中对膜进行封闭。然后洗涤膜，然后用稀释于封闭缓冲液中的第一抗体进行探针检测。使用的第一抗体是BRCAl =MSllO(Merck)或 C20 (Santa Cruz)，Claspin = BL73 (Bethyl)，TopBPl = C33 (BD Biosciences)，肌动蛋白= 克隆 AC15 (Clone AC15) (Sigma-Aldrich)，Chkl =绵羊多克隆抗体(描述于!^eijoo 等人， 2001 中)或 BL2!35 (Bethyl)，磷酸化 Chkl 丝氨酸四6 & 345 (PhosphoChkl Serine 296 & 345)=兔抗体(Cell Signalling ^Technologies)，磷酸化 Chkl 丝氨酸 317 (PhosphoChkl Serine 317)=多克隆兔抗体(Bethyl)，核仁素=C23 (Santa Cruz), CtIP/RBBP8 = C1913 或C1914(Bethyl)。第二抗体是抗兔IgG_HR、抗绵羊IgG-HR和抗小鼠IgG-HR(Jackson Immunologicals)，并利用增强化学发光(ECL) (Amersham Pharmacia)和放射自显影胶片 (FUJI胶片)检测条带。利用每免疫沉淀(IP) 500 μ g至Img的全细胞提取物进行IP。利用5 μ g的非特异性IgG(与IP抗体相同的物种)(Santa Cruz)和过量的洗涤的&平衡的蛋白-G琼脂糖珠子 (Protein-G Sepharose beads) (CR-UK)在4°C下对提取物进行预清除，持续总3小时。然后以14，OOOrpm在4°C下离心提取物30秒，且然后将上清液转移到新的冷冻的Eppendorf 管。然后添加所需要的IP抗体(多达3 μ g)和30 μ L的蛋白-G琼脂糖珠子，并在4°C下在总体积500-1000 μ L的IPLB中过夜孵育。然后在4°C下以14，OOOrpm离心珠子30秒，并用含0. 5M NaCl的IPLB洗涤一次，和用标准IPLB洗涤两次，然后用X2Laemmli SDS上样缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 6. 8、4% SDS、0. 2%溴酚蓝、20%甘油、200mM DTT)洗脱蛋白复合物，并在100°C下加热5分钟。然后通过免疫印迹分析分离的复合物。进一步的实验研究本发明人开始进一步地建立鉴定选择性地干扰Claspin介导的复制能力的分子的方法。预测直接干扰Claspin或其特定下游效应物的分子将导致缺少BRCAl的增殖细胞与表达BRCAl的细胞相比复制失败的增加。为验证该方法，本发明人已开发了测定，所述测定利用比较型双变量荧光激活细胞分选(FACQ分析以定量并比较细胞复制能力的改变。 为证明所述方法的有效性，已将生物信息学用来鉴定Claspin编码序列中，预测针对其的对应的推断的小干扰RNA(siRNA)诱导Claspin表达的敲低的区域，且使用该方法以鉴定具有潜在治疗效力的siRNA。现在描述鉴定靶向Claspin的siRNA的方法，所述siRNA在缺少BRCAl的增殖细胞中诱导复制能力的失败，但在表达BRCAl的细胞中并不进行诱导。
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材料和方法细胞培养将HeLa细胞在37°C和5% CO2下维持在补充有10%胎牛血清的 DMEM(Invitrogen)中。通过在70-80 %汇合时进行胰酶消化(Invitrogen)对细胞培养物进行传代而将细胞培养物维持在次最大汇合。将HCC1937细胞维持在补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1. 5g/L碳酸氢钠、IOmM HEPES、1. OmM丙酮酸钠和4. 5g/L葡萄糖 (Sigma-Aldrich)的RPMI 1640 (Invitrogen)中。为将细胞培养物维持在次最大汇合，在 70-80%汇合时通过胰酶消化(Invitrogen)对细胞培养物进行传代。将UWB1. 289+BRCA1 细胞在37°C和5% CO2下维持在补充有200mg/L G418和3%胎牛血清的50% RPMI-1640和 50%1^611仏0皿3，无庆大霉素/两性霉素钔中。利用0.05%胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen) 每7天两次将细胞以1传4进行传代以将细胞培养物维持在次最大汇合。通过细胞计数测定细胞增殖。瞬时转染将细胞以适当密度接种于6孔组织培养平板中2mL的它们的培养基中， 在M小时中达到60-70%汇合(为每个细胞系进行接种密度优化，数据未示出)。M小时之后用温的PBS洗涤细胞两次，并在无血清培养基(OptiMEM(Invitrogen))中用IOOnM浓度的靶向Claspin的(参见siRNA鉴定)所示SiRNA(Dharmacon)根据生产商的说明利用 Oligofectamine (Invitrogen)转染细胞5小时，经48小时转染两次。每次转染之后，然后用温的PBS洗涤细胞两次，并添加2mL各自的培养基，且然后放置19小时。转染之后，对细胞进行胰酶消化并将细胞接种到60mm皿中且在新鲜培养基中放置48小时。细胞周期分析在如上所述的转染之后，将细胞铺板到IOOmm皿中(5X IO5/平板)。48小时之后，将细胞洗涤到新鲜培养基中并用25mM BrdU(Sigma-Aldrich)脉冲标记 30分钟。为进行收获，然后对细胞进行胰酶消化，并在室温下以IOOOrpm离心5分钟。然后去除上清液，然后将细胞重悬于IOmL的IFA缓冲液(150mM Tris-HCl pH 7. 6、500mM NaCl、 0. 5% NaN3>5% FCS)中。然后在1000rpm、4°C下再次离心细胞5分钟，然后在冰冷的PBS 中洗涤两次并用70% KOH(Sigma-Aldrich)固定。然后在4°C下用1 50稀释的大鼠抗 BrdU抗体(Abeam)对细胞染色2小时，并用1 50稀释的辣根过氧化物酶连接的抗大鼠 IgG在4°C下染色细胞1小时。随后用20mg/mL碘化丙啶(Sigma-Aldrich)对细胞进行DNA的染色，并用200mg/ mL RNA 酶 A(Sigma-Aldricti)进行处理，然后在 LSRII (Beckton Dickinson)细胞计数器上进行测定。采集FACS文件并利用FlowJo ver. 8. 8. 6 (TreeStar Inc)进行测定。蛋白质印迹分析在如上所述的转染之后，将平板置于冰上，并在冰冷的中洗涤两次，然后通过IP裂解缓冲液(20mM Tris醋酸盐pH 7. 5、0. 27M蔗糖、ImM EDTAUmM EGTA, ImM原钒酸钠、IOmM β -甘油磷酸钠、5mM焦磷酸钠、1 % Triton X_100、0. 1 % β -巯基乙醇、1 μ M微囊藻毒素、0. 2mM PMSF、蛋白酶抑制剂鸡尾酒、无EDTA)进行裂解。然后通过3次冻-融循环进一步地裂解细胞，并通过在4°C下以14，OOOrpm离心5分钟去除细胞碎片，通过Bradford测定定量物质。结果和讨论为鉴定预测推断的siRNA以高特异性和高结合亲和力与之结合的Claspin mRNA 编码序列内的区域，使用 AsiDesigner 算法(http://sysbio.kribb.re.kr :8080/ AsiDesigner/menuDesigner. jsf)，其使使用者输入GC含量的阈值和复制序列，且其计算相对的结合能以协助推断的siRNA选择。根据统计学加权的整体表现评分初始排列区域。 虽然未报道Claspin的剪接变体，本发明人希望确保研究所选择的序列靶向具有跨已报道的mRNA转录物的显著分散性的多个外显子。外显子结构、选择用于siRNA设计的区域和所选择的所得的siRNA序列显示于图5中。将对应于图5中所列的序列的SiRNA导入到如材料和方法中所描述的多个细胞系中，包括子宫颈癌细胞系(含野生型BRCA1)和乳腺癌细胞系(BRCA1缺失的)。通过对起始转染之后 60小时收获的细胞裂解物进行免疫印迹而评估Claspin蛋白敲低的程度(图 6，和数据未示出)。DNA合成的整体速率受活性起点的数目以及在复制叉处运行的复制机器的固有催化速率所控制。为分析复制能力，本发明人研究了在短暂的脉冲过程中细胞掺入卤代脱氧核苷酸的能力，作为其在S期内的精确位置的函数。将每个细胞中掺入BrdU的量对该细胞的DNA含量绘制曲线而进行的总细胞群体分析产生了特征性圆弧(图7)，允许精确确定处于细胞周期的Gl期、S期和G2/M期中的细胞的比例。通过测量每个样品群体中处于S期但完全不能掺入BrdU的细胞的比例来定量复制能力的失败程度(对应于图7中感兴趣的区域(RoI))，所述处于S期是通过其具有Gl细胞和G2细胞中间的DNA含量来判断的。在未暴露于任何压力的细胞中，该比例根据细胞生长条件而不同，但通常相当于细胞的 3-4% (图8和图9)。对转染siRNA的细胞中的复制能力进行的分析显示，与非靶向对照相比，靶向Claspin的siRNA导致了 BRCAl缺失的细胞中复制能力失败的程度与表达BRCAl的细胞相比显著的增加。所有靶向Claspin的siRNA在BRCAl缺失的细胞中显示了显著的选择性的复制失败的诱导。该结果有力支持了概念在缺失BRCAl的细胞中对Claspin的选择性抑制可以诱导复制能力的显著失败，和通过该方法进行的复制能力的比较分析具有鉴定选择性地靶向Claspin介导的对复制能力的控制的新颖化合物，以将所述该新颖化合物开发为潜在的治疗剂的极大潜力。本发明所描述的实施方案的多种更改形式和变化形式对于本领域技术人员将是明显的，而不脱离本发明的范围。虽然已参照特定的优选的实施方案描述了本发明，应理解所要求保护的本发明不应过度局限于所述特定的实施方案。事实上，本发明意在覆盖对于本领域技术人员明显的所描述的进行本发明的方法的多种更改形式。
权利要求
1.一种鉴定不显著抑制BRCA功能的claspin调节剂、或调节参与DNA复制进程的 Claspin依赖性控制的下游组分但不显著抑制BRCA功能的剂的体外方法，所述方法包括以下的步骤(a)将其中BRCA和claspin功能基本上正常的第一细胞群体与受试剂接触；(b)将其中消除了BRCA但其中claspin是功能性的第二细胞群体与所述受试剂接触；(c)将所述第一细胞群体和第二细胞群体暴露于复制压力；和(d)确定所述受试剂对所述第一细胞群体和第二细胞群体的复制、增殖或存活的作用。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述BRCA是BRCAl。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述复制压力通过化学方法来获得。
4.如权利要求1-3所述的方法，其中所述复制压力通过干扰DNA复制的剂来获得，所述干扰DNA复制的剂优选地为抗肿瘤剂。
5.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一细胞群体包括HeLa细胞系、U20S细胞系或MCF-7细胞系的细胞。
6.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二细胞群体包括HCC1937细胞系和 SUM1315M02细胞系的细胞。
7.如任一前述权利要求所述的方法，其中步骤(d)包括用卤代脱氧核苷酸脉冲标记所述第一细胞群体和第二细胞群体，然后进行FACS分析。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述FACS分析是比较型双变量FACS。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述比较型双变量FACS用来测量复制能力失败的程度以定量每个样品群体中处于S期但不能掺入BrdU的细胞的比例，所述处于S期是通过所述细胞具有Gl细胞和G2细胞中间的DNA含量来判断的。
10.一种纯化的claspin抑制剂。
11.如权利要求10所述的纯化的claspin抑制剂，其中所述抑制剂是claspin特异性抗体或claspin特异性核酸调节剂。
12.如权利要求11所述的纯化的claspin抑制剂，其中所述抑制剂包括如SEQID NO 1至13中任一个所示的claspin特异性核酸调节剂。
13.如权利要求12所述的抑制剂，其中所述核酸调节剂包括SEQID NO :2、4、6、8、9、 10、11、12或13，或其组合。
14.如权利要求13所述的抑制剂，其中所述核酸调节剂包括SEQID NO :9、10、11、12或 13，或其组合。
15.如权利要求13所述的抑制剂，其中所述核酸调节剂是SEQID NO :1和SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9和互补序列、SEQ ID NO 10和互补序列、SEQ ID NO 11和互补序列、 SEQ ID NO 12和互补序列、以及SEQ ID NO :13和互补序列的双链体，或其组合。
16.一种claspin调节剂，所述claspin调节剂用于治疗细胞增殖疾患。
17.一种claspin调节剂，所述claspin调节剂与靶向DNA复制的至少一种剂组合以用于治疗细胞增殖疾患。
18.如权利要求17所述的调节剂，其中在所述治疗过程中所述claspin调节剂与所述抗复制剂的组合是复合的、顺序的或同时的。
19.如权利要求17或18所述的调节剂，其中所述靶向DNA复制的剂是抗肿瘤剂。
20.如权利要求16至19中任一项所述的调节剂，其中所述细胞增殖疾患与受损的 BRCA功能相关。
21.如权利要求20所述的调节剂，其中所述BRCA是BRCAl。
22.如权利要求16至21中任一项所述的调节剂，其中所述细胞增殖疾患是癌症。
23.如权利要求16至22中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂是claspin特异性抗体或claspin特异性核酸调节剂。
24.如权利要求16至23中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂调节claspin的活性或表达。
25.如权利要求16至24中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂是抑制剂。
26.如权利要求16至25中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂是核酸调节剂且所述核酸调节剂是RNA抑制剂或反义寡聚物。
27.如权利要求16至26中任一项所述的调节剂，所述调节剂用于治疗预先确定患有癌症的动物。
28.如权利要求16至27中任一项所述的调节剂，其中所述调节剂是包括SEQID NO 1至13中任一个的抑制剂。
29.如权利要求28所述的调节剂，其中所述核酸调节剂包括SEQID NO :2、4、6、8、9、 10、11、12或13、或其组合。
30.如权利要求29所述的调节剂，其中所述核酸调节剂包括SEQID NO :9、10、11、12或 13、或其组合。
31.如权利要求29所述的调节剂，其中所述核酸调节剂包括SEQID NO :1和SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9和互补序列、SEQ ID NO 10和互补序列、SEQ ID NO 11和互补序列、SEQ ID NO 12和互补序列、以及SEQ ID NO :13和互补序列的双链体、或其组合。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包括claspin调节剂。
33.如权利要求32所述的药物组合物，所述药物组合物还包括靶向DNA复制的剂。
34.如权利要求32或权利要求33所述的药物组合物，所述药物组合物还包括生理上可接受的赋形剂或佐剂。
35.如权利要求16至31中任一项所述的调节剂或如权利要求32至34所述的药物组合物，其中靶向DNA复制的所述治疗或剂包括选自由以下组成的组的剂甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、硫替哌、丝裂霉素C、氮丙啶基苯醌(AZQ)、白消安、卡氮芥(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、福莫司汀、卡钼、道诺霉素、多柔比星或亚德利亚霉素、表柔比星、更生霉素或放线菌素D、米托蒽醌、安吖啶、替尼泊苷、依托泊苷、伊立替康、托泊替康、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、紫杉醇、泰索帝，和其混合物。
全文摘要
本发明涉及用于治疗细胞增殖疾病或疾患的剂，和用于鉴定所述剂的测定。
文档编号A61K39/395GK102460163SQ201080030885
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者卡尔·斯迈思, 理查德·班尼斯顿 申请人:谢菲尔德大学