溶解存在于样品中的微生物、提取并提纯所述微生物的核酸以用于分析目的的自动化系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明的技术领域是生物学分析领域。更特别地，本发明首先涉及用于溶解存在 于环境或临床样品中的微生物、用于提取并用于提纯所述微生物的核酸的装置。本发明还 涉及用于溶解微生物、用于提取和提纯所述微生物的核酸以用于分析目的的自动化系统。
【背景技术】
[0002] 若干年来，在医院中的院内感染的发生率已有了相当可观的增长。这些感染被解 释为由于就医人员的污染（这些人员因此为限定免疫抑制），并由于存在于医院环境中且 不管如何始终谨慎地进行设备和表面的消毒以及空气调节也无法消灭的致病微生物所致。 考虑到这些越来越频繁的环境微生物污染的情况，用于改善和便于环境控制的装置和方法 的开发已成为保健专业医生的主要挑战。
[0003] 且不说院内感染的问题，对环境状况的监控在近些年来在工业环境、特别是在食 品工业和制药或化妆品工业中已经成为周期性发生的关注点。在食品工业中，我们熟悉产 品的、或甚至原材料的致病微生物污染对于消费者的健康可能具有的灾害性后果。事实上， 由于细菌（诸如李斯特菌属或沙门氏菌属中的那些）导致的有毒食品感染现在是屡见不 鲜。对空气质量的监控在制药或化妆品工业的质量方法中也是关键过程。
[0004] 此外，这种监控必须符合曾经的需求增长水平，由于日益严格的规障。
[0005] 在对保健专业医生或制造者而言可得到的以用于执行环境监控的工具中，空气生 物取样器（biosampler)是用于检测空气中的微生物的选择方案。这些装置在我们希望测 量空气生物污染的地方被放置在合适的点处。它们通常包括连接到培养介质的空气取样 器。由空气取样器收集的空气与培养介质形成接触；收集到的任何空气传播的微生物将被 沉积在所述培养介质上。培养介质然后被回收并被放在炉中以促进微生物的生长。于是便 可以通过传统的微生物技术来检测和识别所述微生物。
[0006] 然而，这些装置具有与所采用的技术相关的主要缺点。该缺点是获得分析结果所 花费的时间。事实上，传统的微生物技术、尤其是细菌学的使用，包含等待细胞生长、或甚至 在特定的培养介质上的再播步骤所必需的培育次数以允许识别。结果，当我们希望检测和 识别是院内感染或食物中毒的原由的致病生物体时，为获得结果所花费的时间相对很长， 或甚至太长。
[0007] 该类装置的另一个缺点是，尽管培养介质的使用使得在细菌的属和种之间进行区 分成为可能，但其通常不能在同一个细菌种的菌株之间进行区分。现在，已知的是微生物的 致病性可能取决于上述的菌株而显著改变。
[0008] 此外，该类装置具有其不允许检测能存活但不可栽培的空气传播的微生物的缺 点。
[0009] 这些装置还具有养分表面随着收集的继续而干燥的缺点。
[0010] 此外，存在目的在于回收空气传播的粒子、尤其是微生物的装置。因而，文献 GB-2254024描述了基于旋风效应原理的用于收集存在于空气中的粒子的装置。尽管这种装 置证明适合于收集存在于空气中的粒子，包括微生物，但其还从未针对处理这样获得的样 品进行调查，特别是针对执行意在被用于分析的遗传物质的提取方面。
[0011] 更一般地，在识别微生物和/或传送结果的速度方面最相关的技术，无论是对于 临床样品还是环境样品而言，毫无疑问是分子诊断技术。这些技术，基于对微生物的遗传物 质的分析，并且特别是对感兴趣的某些特定的序列的分析，使得能够在记录时间中获得对 微生物的非常精确的识别，因为它们使得能够省略培养步骤。
[0012] 然而，这些技术的使用具有一定数量的限制，其中最重要的是存在于空气中的并 因此可回收以用于执行分析的微生物的潜在有限的量。事实上，已知的是，环境样品，而且 还有某些临床样品，在微生物方面是相对贫乏的。结果，从该原材料中获得的遗传物质的量 很小。用来提取核酸的技术在产量方面的性能于是就成了至关重要的参数。
[0013] 此外，大部分用于溶解的微生物的现存的技术相对于所有微生物而言是不通用的 和/或需要有资质的人员的干预以便执行手动步骤。
[0014] 文献W0-A-2005/038025描述了用于从特别是自空气中采样的微生物中提取核酸 的方法。该方法包括采用三个不同的溶解方法，即化学溶解、热冲击溶解和机械溶解。如果 这种方法使得能够毫无疑问地优化提取核酸的效率并因此增加可用的遗传物质的量以用 于分析，那么情况仍然是该效率依然依赖于回收的微生物的量。现在，针对优化所述微生物 的回收该文献中什么都没有描述。
[0015] 文献US-A-5, 707, 861描述了用于破坏活细胞诸如微生物的装置。该装置允许细 胞利用玻璃珠子和由于在包含微生物的管与承载所述管的支撑件的孔之间的空间所致的 振动效应两者被溶解。因此，这种装置使得能够优化细胞的溶解并因此优化遗传物质的提 取。这种装置及其采用的方法具有与上面所述的那些装置同样的限制，即它们仍依赖于回 收的微生物的量。此外，它们具有另外的缺点：需要随后的浓缩核酸的步骤以便使它们与细 胞碎片分离。最后它们需要在浓缩步骤结束时手动地回收核酸。
[0016] 这些问题也出现在文献US-5, 567, 050中所描述的装置上。
[0017] 具有较高集成的系统也已被描述。因而，文献W0-A-2004/018704描述了一种用于 收集空气中的微生物并识别它们装置，以及使用PCR(聚合酶链反应）扩增技术的相关的方 法。该系统被特别地设计用于在邮件分类中心防止通过生物污染的暗杀企图。该系统包 括沿着用于运输邮件的回路放置的空气采样装置，用于通过旋风效应筛选/分离粒子的装 置，用于从液体样品中浓缩/回收粒子的装置，用于将样品的片段传递至来自加利福尼亚 的Cepheid公司的GeneXpert?PCR分析盒中的装置。该盒然后被手动地传递到一独立的 自动化生物分析仪以用于识别从空气中收集的一种或多种微生物。
[0018] 尽管该系统解决了与上述的装置和方法有关的许多技术问题，然而其仍具有较多 缺点。这些缺点中的第一个是用于在传递到分析盒之前进行样品处理（收集、分离、浓缩/ 回收）的系统相对复杂和昂贵。第二个缺点是所收集的微生物在液体样品中被回收，仅其 一小部分被分析。这意味着存在没有回收所有的微生物并因此没有回收所有的核酸的相当 大的风险，这极大地限制了分析的适用性。此外，不管其复杂性如何，该系统需要将该盒手 动传递至GeneXpert?自动化分析仪中。
[0019] 申请人已经提交了一项主要涉及盒的专利申请W0-A-2009/001010,所述盒合适于 放置在空气采样装置内并适合于接纳用于回收核酸的装置，具有粗略的圆柱形状的所述盒 包括微生物的保持区域，所述保持区域包括用于溶解微生物的装置。该发明还涉及用于收 集空气传播的微生物的装置和用于溶解微生物的装置。
[0020] 申请人还提交了一项专利申请W0-A-2010/067019,该申请除了其它方面以外涉及 用于收集空气传播的微生物的装置，所述装置包括：
[0021] ?空气采样模块，其包括：
[0022] i.包括空气导入导管的上部元件，所述空气导入导管允许空气流进入所述模块， 所述导管在其基部处具有用于干扰空气流的装置，
[0023] ii.包括用于排出空气的装置的下部元件，其允许所产生的空气流排出，
[0024] 所述上部和下部元件与彼此集成使得空气流能够在所述空气采样模块内被产生 是可能的；
[0025] ?盒，其具有粗略的圆柱形状，其包括微生物的保持区域，所述保持区域包括用于 溶解微生物的装置，所述盒被定位在所述空气采样模块内部。
[0026] 通过这两个新颖的方案，不可否认的是，该过程被改善为对于任选地处于植物性 状态或呈孢子形式的大量的微生物而言（不论它们是细菌、病毒还是或真菌）具有通用的 溶解、并对于环境样品和临床样品都有效。
[0027] 此外，有着相当高的微生物浓度，该系统与各种下游分析（诸如PCR，皿上划线， 等）相容，并且机械溶解被集成。
[0028] 然而，当可能找到更优的方案时，满足于运行良好的系统并不是人类的本性。因 此，在这两个例子中，收集仍受限于气态或液态流体的体积，该流体与回收介质（通常为培 养介质）形成接触。流体流将始终在同一点上撞击该介质，这将导致：
[0029] ?要么所述介质在精确的点处饱和而其余部分未被使用，
[0030] ?要么该介质老化，因为其始终在同一个（些）点处被气体或液体撞击，这在气体 的情况下导致介质表面的干燥并且在液体的情况下导致介质表面的液化。在这两种情况下 并且特别是在琼脂干燥的情况下，捕获效率随着时间将会有非常明显的下降。
[0031] 此外，通过撞击的捕获方式对于具有小于1 y m的直径的小粒子来说非常低效。另 一个问题是存在一部分回收介质（具有甘油的珠子）被空气流挟带的风险。因此，流体的 这种投射及其在所述介质上的反弹可能产生弹着点，这又是另一个污染的风险。
【发明内容】
[0032] 本发明的目的是提出一种解决了上述的缺点的设备。
[0033] 为此，本发明提出一种用于收集包含在流体中的微生物的装置，所述装置包括：
[0034] ?包含一组珠子的反应模块，
[0035] ?至少一个流体导入导管，其允许流体流进入所述模块，
[0036] ?至少一个用于排出流体的导管，其允许已经通过所述模块内部的所述流体流排 出，
[0037] ?在所述模块内的珠子保持装置，
[0038] ?用于导入至少一种反应液体的至少一个通道，
[0039] ?