使用定点衍生化和lc/ms/ms工作流程分析一组脑腱黄瘤病生物的制作方法

使用定点衍生化和lc/ms/ms工作流程分析一组脑腱黄瘤病生物的制作方法
【专利说明】使用定点衍生化和LC/MS/MS工作流程分析一组脑腱黄瘤 病生物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求了 2012年5月18日提交的美国临时申请第61/649, 044号的优先权， 所述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
[0003] 政府许可权利
[0004] 本发明可能已经部分地在政府支持下，在NCRR和NIH的NCATS授予的OCTRI基金 编号5KL2 RR024141-04下完成。政府可以拥有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本文所述的教示涉及使用标记试剂分析酮固醇胆汁酸前体的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0006] 新生儿筛查程序可以通过遗传病症的早起检测和治疗有效地拯救生命以及防止 严重的病态（例如智力迟钝）。因此，筛查新生儿应该扩大到包括额外失调症，特别是具有 治疗选择的失调症。
[0007] 其中新生儿筛查程序可能特别有用的遗传病症包括那些涉及固醇路径改变的 遗传病症。这些病症可以导致过早的死亡和发病且包括病症例如脑腱黄瘤病（CTX)、 Smith-Lemli-Opitz综合症、家族性高胆固醇血症和先天性肾上腺增生。CTX在最近的一份 美国大学医学遗传学报告中已经被确定为普遍新生儿筛查的候选疾病。然而，为了有效， CTX的筛查和/或诊断方法必须具有足够的灵敏性和选择性。
[0008] CTX是由CYP27A基因（CYP27A基因也被称为固醇27-羟化酶基因）的突变所引起 的一种罕见遗传性固醇病症。CYP27A基因与在产生胆汁酸过程中具有重要性的P450酶有 关。当CYP27A活性被抑制或阻断时，胆汁酸前体将在各种组织中积累。CTX经常在幼年时 期呈现，且伴随着由酮固醇胆汁酸前体和其衍生物的积累所引起的症状缓慢增加。CTX经常 直到成年期才被确诊，而此时已经造成显著损害。CTX的生化表型显示在图12中。
[0009] 先前曾经考虑过筛查27-羟化酶缺陷的生物标记物。然而，CTX的生物标记物是 酮固醇生物标记物化合物，且因为这些生物标记物在临床和生物样品（例如血浆）中的含 量通常很低，所以这种筛查提出了挑战。另外，所述生物标记物可能以甚至更低的含量存在 于未受影响的个体中，从而使得难以获得参照。当使用反相（RP)色谱法时，高疏水性酮类 固醇给色谱分析带来了挑战。通过质量分析来检测和量化酮固醇生物标记物类固醇同样特 别有挑战性，因为此类化合物的电离效率不良、电离图案复杂、同重元素化合物干扰质量测 量以及样品介质中的低样品浓度。
[0010] 可利用标准色谱技术（例如GC-MS方法）进行化学衍生后的分析。参见例如 Song, J.等人，Journal of Chromatography B·，791 卷，1-2 期，（127-135) 2003,其内容以 引用的方式并入本文中。还可以利用使用荧光检测和某些免疫分析（包括放射免疫分析 (RIA))的方法，但这些方法通常不提供多组分分析。使用RIA的主要问题是缺少特异性和 需要对每种类固醇进行不同分析。
[0011] 用来分析在CTX和肠道疾病中积累的酮固醇（例如5α-胆固-3-酮和其它 胆汁酸前体）的一种现有分析方法已被描述在（例如）美国专利案第8, 158, 435号； Andrea E.DeBarber 等人：Clinica Chimica Acta，411(2010)43-48;Akira Honda 等人： The Journal of Biological Chemistry 276, 37(2001)34579-34585;和 MCamilleri 等人 Neurogastroenterol Motil (2009)21，734_e43技术说明中，所述文献以引用的方式并入本 文中。GC-FID或GC-MS被用于CTX的生化筛查，所述筛查使用Girard P衍生化和ESI-MSMS 检测。然而，基于GC的方法的限制包括长分析时间（>30min)和复杂的样品制备。
[0012] 以上与检测和量化样品中的酮固醇生物标记物化合物有关的挑战在希望快速筛 查和/或分析大量生物样品中的特定受关注化合物或一组酮固醇胆汁酸前体时被放大。
[0013] 另外，传统方法可能耗费人力且缺少测量正常未受影响患者的血清或全血样品所 必需的灵敏性，特别是对通常只能获得少量样品的新生儿筛查来说。因此，希望拥有用于分 析受影响人类样品和正常人类样品中的CTX生物标记物水平的简单和特定方法。
[0014] 因此，仍然需要适用于确认和量化CTX的具灵敏性且选择性的筛查测试。此测试 优选对量化酮固醇和可用作CTX标记物的其它分析物具有灵敏性和特异性。

【发明内容】

[0015] 根据本教示的一些广泛方面，公开了用于检测和量化人类样品（例如受影响或正 常的人类样品）中的CTX和IBS(肠易激综合症）生物标记物的方法。在许多实施例中，这 些方法使用本文所公开的季氨氧基（QAO)试剂，以提高受关注分析物（例如CTX生物标记 物）的电离效率，从而经由质谱法检测实现所需LL0Q，即使对于低体积（例如小于约5微升 (μ L)的样品体积，如小于10 μ L的样品体积，例如在约3至约5 μ L的范围内）样品来说。 酮固醇胆汁酸前体是CTX和IBS生物标记物的实例。
[0016] 在各个实施例中，本文所公开的同位素富集型季氨氧基试剂可以用于通过与洁净 标准物的简单反应来制造每种受关注分析物的内标物。在一些实施例中，可以通过用本文 所公开的季氨氧基试剂的同位素变体标记已知浓度的多种生物标记物分析物（即，用QAO 试剂的不同同位素变体标记每种生物标记物）来制造一组生物标记物的内标物。可以将这 些内标物添加到测试样品中以允许受关注生物标记物的绝对量化。
[0017] 在各个实施例中，根据本教示的方法可以用于酮固醇生物标记物的高灵敏性和特 异性分析，这允许从各种样品（包括具有低体积和复杂生物基质的样品）中检测酮类固醇 胆汁酸前体。
[0018] 在一些实施例中，公开了一种诊断或筛查27-羟化酶缺陷的方法，其包括用QAO试 剂（例如以上所公开的QAO试剂）处理人类样品以标记样品中的一种或多种酮固醇胆汁酸 前体，以及对经处理的样品进行LC-MS分析以检测和量化标记前体。
[0019] 在某些情况下，上述方法可以进一步包括通过用本文所公开的不同同位素标记 QAO试剂标记已知浓度的不同酮固醇胆汁酸前体制备一种或多种内标物。在一些实施例中， 这些内标物可以用来同时量化一组生物标记物，例如使用LC-MS。例如，在一些实施例中，使 用这些内标物允许在LC-MS光谱仪的单次操作中检测和量化一组生物标记物。
[0020] 在一些实施例中，用于标记供质量分析用的酮固醇胆汁酸前体的季氨氧基（QAO) 试剂包括式（I)标记试剂：
[0021] Y- (CH2)n-O-NH2(I)
[0022] 其中η是2、3、4、5或6且Y是：
[0023]
【主权项】
1. 一种诊断或筛查27-轻化酶CYP27A1缺陷的方法，其包括： 用式（I)的标记试剂或其盐或水合物使包含一种或多种丽固醇胆汁酸前体的分析物 衍生化，W形成标记分析物： ￥-畑2)。-〇-畑2 讯 其中n是2、3、4、5或6,且Y是：
每个R4独立地为H或支链或直链C i-Ci8焼基， m是1与20之间的整数，且 X是阴离子； 电离所述标记分析物； 通过质量分析检测所述标记分析物的特征离子碎片；W及 比较所述特征离子碎片与标准物的特征离子碎片的强度。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述27-轻化酶CYP27A1缺陷是由脑膊黄瘤病CTX 所引起。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述27-轻化酶CYP27A1缺陷是由A 4-3-氧代类 固醇-5B还原酶缺陷所引起。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种丽固醇胆汁酸前体包括下列各项 中的一个或多个： 7a-胆固帰-3-丽； 5a-胆固焼-3-丽； 4-胆固帰-3-丽； 7 a，12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽； 7 a -轻基-5目-胆固焼-3-丽；W及 7 a，12 a _二轻基-5 0 -胆固焼-3-丽。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种丽固醇胆汁酸前体包括7 a-胆固 帰-3-丽、5 a -胆固焼-3-丽、4-胆固帰-3-丽和7 a，12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽中 的至少两个。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述衍生化包括使包括7 a -胆固帰-3-丽和 7 a，12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽的一组分析物衍生化。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述分析物组包括7 a -胆固帰-3-丽、5 a -胆固 焼-3-丽、4-胆固帰-3-丽和7 a , 12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述标记试剂具有W下结构：
或其盐或水合物。

9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物是从生物基质获得。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述生物基质包括鲜血、干血粉、血清或血浆。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述生物基质的体积为10 y L或更少。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述特征离子碎片为中性丢失碎片，其包括所述 分析物和所述标记试剂或其部分的结构碎片。
13. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括W下步骤：用式（I)的标记试剂使一种 或多种标准化合物衍生化W形成标记标准物，其中所述标记标准物经同位素富集，W及电 离所述标记分析物和所述标记标准物二者。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述标准化合物包括7 a -胆固帰-3-丽和 7 a，12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽。
15. 根据权利要求13所述的方法，其中所述检测是在单次质量分析操作中进行。
16. 根据权利要求13所述的方法，其进一步包括测量所述标记分析物相对于同位素标 记标准物的相对浓度。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中电离所述标记分析物的所述步骤是利用约10至 约130eV范围内的碰撞能量进行。
18. -种用于分析丽固醇胆汁酸前体的试剂盒，其包括： 一组丽固醇胆汁酸前体标准物； 一组质量标记，其包括两种或更多种式（I)化合物： ￥-畑2)。-〇-畑2 讯 其中n是2、3、4、5或6且Y是：
每个R4独立地为H或支链或直链C i-Ci8焼基， m是1与20之间的整数，且 X是阴离子； 或其盐或水合物， W及缓冲剂、试剂、分离柱和用于进行分析的说明书中的一个或多个。
19. 根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述组的丽固醇胆汁酸前体标准物包括下列 各项中的两个或更多个： 7a-胆固帰-3-丽（7a C4); 5 a -胆固焼-3-丽； 4-胆固帰-3-丽； 7 a，12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽； 7 a -轻基-5目-胆固焼-3-丽；W及 7 a，12 a _二轻基-5 0 -胆固焼-3-丽。
20. 根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述组的丽固醇胆汁酸前体包括7 a -胆固 帰-3-丽和7 a , 12 a -二轻基-4-胆固帰-3-丽。
【专利摘要】本发明提供用于分析人血浆、血清或全血中的酮固醇生物标记物(例如胆汁酸前体)的方法、标记试剂、标记试剂组和标记技术。此方法被用于筛查新生儿的脑腱黄瘤病CTX。此外还揭示了用于标记、分析和量化酮固醇生物标记物的方法，以及同样使用质谱法的方法。
【IPC分类】G01N33-50, G01N33-48
【公开号】CN104603617
【申请号】CN201380026048
【发明人】A·迪巴贝尔, S·普卡雅斯特哈, R·D·施泰纳, M·魏茵斯托克
【申请人】Dh科技发展私人贸易有限公司, 俄勒冈健康与科学大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年5月17日
【公告号】CA2873650A1, EP2850430A1, WO2013171568A1