基质平铺在培养皿上，放入培养箱待用。
[0048]2.1.3 土壤动物
[0049]采用弹尾目昆虫东洋棘跳0.yodai，该物种通过实地野外采集培养。
[0050]用于实验的东洋棘跳需先进行同步化繁殖以获得同龄个体。即从实验室培养箱中取出要用的东洋棘跳培养皿，用毛笔仔细收集产出的卵，转移到“卵片”(浸在石膏粉/炭浆里的小片滤纸)上，然后放置在培养基上。在基质上添加几粒酵母以吸引幼虫离开卵片。注意卵片和基底必须是潮湿的，否则卵将会脱水。同时放置一两头成虫以清除坏死的卵。然后标记日期和跳虫品种，用封口膜给培养基封口，放入培养箱中以12-12h亮暗周期，20± 1°C培养。三天后，卵片上的大部分卵已经孵化，用镊子将带有孵化卵的卵片从培养皿中移除，用毛笔将成虫和未孵化的卵挑出。幼虫留在培养皿中，喂以面包酵母，封口后继续放入培养箱中培养25天用于实验。
[0051]2.1.4实验仪器
[0052]本次实验主要用到的仪器是烧杯、镊子、培养罐、培养皿、培养箱、干燥柜、烘箱、显微镜、天平、电热消解仪、火焰炉等。
[0053]2.2实验方法
[0054]2.2.1重金属镉对东洋棘跳生态毒性的测定
[0055]用CdCl2.2.5Η20配置成水溶液，加土壤中，充分搅拌至均匀，配制成供试系列浓度处理组:空白对照组为OCd mg.kg—1 (只加相应量的水，不加Cd)，试验组为25、50、100、200和400Cd mg -kg^1处理组，这样，对照组加上实验组的5个浓度处理组，共6个处理组。该6个浓度处理组均设4个重复。平衡48h后，加入适量蒸馏水，调节土壤含水量至最大持水量的50%。分装至培养罐(由55mm高、55mm内径、5mm壁厚的有机玻璃环加底加盖组成)中，每罐30g 土壤。收集同步化24-26天的东洋棘跳，每培养罐(即，各处理组的每个重复)加10头雌虫和5头雄虫，并添加3mg干面包酵母。放入人工气候箱中(20±1°C)培养35天。每隔I周加入适量的蒸馏水，以补充蒸发水量，并添加酵母。实验结束后，用自制的自动控温高温高梯度小节肢类土壤动物定量收集设备(申请号:201310150590.1)烘虫2天，收集存活的成虫和繁殖的幼虫于收集皿中。
[0056]在收集皿中加1mL蒸馏水，利用弹尾目昆虫体表的蜡质将其悬浮。用自行改装的土壤动物计数测量装置(申请号:2013042800772030)，对成虫和幼虫分别进行数量统计，并对所有成虫以及半数以上的幼虫进行体长测量。
[0057]2.2.2东洋棘跳的计数与长度测量
[0058]2.2.2.1 计数
[0059]先给每个培养基拍照，通过数字图像处理软件(ImageJ)，将图片导入软件，点plugins键选择Analyze中的Cell Counter键,在跳出的对话框中先点击Initialize初始化图片，放大图片至100%比例，选择合适的颜色标记(Type)，然后对幼虫进行计数。
[0060]2.2.2.2 长度测量
[0061]打开ImageJ，设置测量尺度，用直线工具标记处台微尺的刻度，然后用analyze-set scale 功倉泛设置测量标尺，known distance:1 ；unit of length:mm ;选择global。然后导入图片，用segmented line标记需要测量长度的跳虫，沿着东洋棘跳的中线连线，接着用analyze-measure测量(按下m同时按下d),在results框中显示的即为所需结果。
[0062]2.2.3统计分析
[0063]用SAS %1^0119.1.3统计分析软件对试验数据进行统计分析。使用一般线性模型(General Linear Models, GLM)程序对不同浓度Cd处理下的各个指标进行F检验,用Dunnet检验对处理与空白对照组间进行差异显著性分析，获得最大无效应浓度(NOEC)值和最低效应浓度(LOEC)值[16]。
[0064]实施例1
[0065]在空白对照组中，东洋棘跳成虫的存活率大于80%)，繁殖数(加入的成虫在试验期间繁殖出来的幼虫数量)高于100头，如图2-3。实验过程没有出现逃逸的情况，并且繁殖良好。另外一方面，实验时间35天能保证东洋棘跳正常繁殖。然而，经F检验，成虫存活数(p=0.88，F5j22=0.5156)和繁殖幼虫数(p=0.0743，F5；22=2.48)在空白对照组和试验组5个浓度处理组总共6个处理间均没有出现显著差异。
[0066]在包括空白组和试验组总共6个处理组中，对每个重复(培养罐)中所有存活下来的成虫进行体长测量，结果表明，在Cd处理的土壤中，成虫体长显著减小(F5，33CI=3.07，p〈0.05)。如图4所示，相对于空白对照组，400mg kg—1浓度处理组中的成虫体长减少了8.41%(p〈0.05)。Cd对土壤中东洋棘跳成虫体长的NOEC值为200mg kg_1, LOEC值为400mgkg'各浓度梯度Cd处理的土壤中，成虫体长主要分布在0.8?1.7cm范围内。
[0067]对于幼虫体长测量，由于试验过程中繁殖的幼虫数量较大，因此，在每个重复中，随机取一半左右的幼虫进行体长测量，每处理组约测250头，全部6个处理组测约1500头幼虫。结果表明，在Cd处理的土壤中，幼虫体长显著减小(F5，1449=2.82，p〈0.05)。如图5所示，相对于空白对照组，400mg kg—1浓度处理组中的幼虫体长减少了 12.7%(p〈0.05)。LOEC值为25mg kg'各浓度梯度Cd处理的土壤中，幼虫体长主要分布在0.2?0.8cm范围内。
[0068]本实验发现成虫体长分布在0.8?1.7cm范围内，幼虫体长分布在0.2?0.8cm范围内，经历35天时间的培养(培养至东洋棘跳虫龄为59-61天，保证了东洋棘跳的正常繁殖，同时，又使幼虫体长区别于成虫体长，便于结果的统计与分析。
[0069]结论
[0070]成虫体长和幼虫体长在Cd污染的胁迫下，均出现显著的减小，该两个指标对Cd产生了响应，表明对Cd污染敏感。东洋棘跳这两个指标均能指示镉污染，其中，幼虫体长更为敏感。将同步化24?26天东洋棘跳(每罐中雌虫10头和雄虫5头)在测试土壤样品中培养35天的方法适用于Cd的生态毒性测试，
[0071]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1.一种评价待测样品中是否存在重金属污染的方法，其特征在于，以东洋棘跳(Onychiurus yodai)作为指示物种,包括: 在待测样品中培养同龄化的东洋棘跳，收集培养至虫龄59-61天的成虫及其在培养期间繁殖并生长至24-26天幼虫，观察其体长，如其体长显著减小，则该待测样品中存在重金属污染。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括:将东洋棘跳同龄个体分成试验组和空白对照组，将试验组培养于待测样品中，将空白对照组培养于已知不含重金属的样品中，观察试验组中东洋棘跳的体长；如待测样品中东洋棘跳的体长与空白对照相比在统计学上显著性减小，则该待测样品中存在重金属污染。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于所述方法的东洋棘跳的数目大于10头；更佳地大于15头；更佳地，用于所述方法的东洋棘跳中，雌雄虫比例为2:1。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，培养温度为20±2°C;空气湿度为75 ±10% ;或 一天中，光照时间12小时，光照强度为600Lux ;黑暗时间12小时。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，培养过程中，东洋棘跳喂食酵母和水。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，收集获得的成虫或幼虫，烘虫1-3天，测定成虫或幼虫的体长。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的重金属是镉。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是土壤。
9.东洋棘跳的用途，其特征在于，用于通过测量其体长变化评价待测样品中是否存在重金属污染。
10.一种评价待测样品中是否存在重金属污染的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括: 东洋棘跳；较佳地为同龄化的东洋棘跳；和/或 测量昆虫体长的仪器。
【专利摘要】本发明涉及一种评价土壤中化学物质生态毒性的方法。本发明人根据东洋棘跳的生物学特性和生活史特征，设计了单物种生态毒性测试的方法，利用东洋棘跳个体水平和种群水平的变化快速有效地检测土壤中化学物质的生态毒性。
【IPC分类】G01N33-24
【公开号】CN104634941
【申请号】CN201310559787
【发明人】柯欣, 骆永明, 宋静, 秦佳祎, 章海波, 涂晨
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院, 中国科学院南京土壤研究所, 中国科学院烟台海岸研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月12日