一种灵敏度高的连续检测法gldh检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，属于临床体外检测技术 领域。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸脱氢酶（GLDH或GDH)是线粒体酶，主要存在于肝脏、心肌及肾脏，少量存在 于脑、骨骼肌及白细胞中，其中以肝细胞含量最为丰富，且几乎全部集中于线粒体基质中。 GLDH为肝线粒体特异性酶，健康人正常情况下血中含量很低，但在肝细胞损伤或坏死时可 进入血流，使血清中GLDH活性明显增高。谷氨酸脱氢酶只在肝、胆系疾病中出现升高，而在 其他非肝胆性疾病中并不升高，因此说明谷氨酸脱氢酶具有极强的特异性。谷氨酸脱氢酶 在急性缺血性肝炎中谷氨酸脱氢酶的阳性率可达100%，是诊断急性缺血性肝病的重要指 标。测定血清中GLDH活性可作为诊断肝细胞病变，特别是急性坏死性肝炎和酒精性肝炎的 重要指标之一，同时，动态观察GLDH变化，对其治疗的效果及预后有重要意义。而对于其他 一些疾病，GLDH也有诊断价值，并且有应用和开发前景。
[0003] 目前检测血清谷氨酸脱氢酶的方法多建立在以连续监测法为基础的检测方法，该 方法的原理为血清中的GLDH，以α -酮戊二酸为基质，在340nm的波长下测定还原型辅酶 I的氧化速率，从而求得谷氨酸脱氢酶的的活力，该方法操作简单，产品抗干扰能力强，并且 能够很好地结合全自动生化分析仪器的使用，非常有利于临床中的使用和推广，但是本方 法是酶促反应，反应的力度非常小，造成一般检测试剂的分析灵敏度非常的小，再加之人体 中GLDH的含量非常的少，正常人体中的含量一般在0-8U/L左右，因此当结合全自动生化分 析仪器使用时容易造成检测结果重复性差，检测结果出现〇值和负值等问题，这给临床中 的使用和推广造成不小的影响。
[0004] 要想提高血清GLDH的检测结果的准确性和重复性，首先要做的就是要提高生化 试剂的分析灵敏度，因此本发明根据这个思路，在连续监测法的基础上进行优化，提高生化 试剂的分析灵敏度，增加检测结果的准确性和重复性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂。
[0006] 本发明采用双试剂方法检测血清和血浆中GLDH的含量。该试剂盒在试剂Rl中优 先选择了 CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液作为基础缓冲液，这种缓冲液在pH为 8. 6-10. 0范围内有较好的缓冲能力，液缓冲能力强，非常适合整个反应的进行。在试剂Rl 中加入了 GLDH激活剂激L-亮氨酸，从而放大了 GLDH酶类的活性，使谷氨酸脱氢酶在非常 低的浓度下也能够检测出，同时还在Rl试剂中添加了 PEG6000和TRIT0NX-405这两种表面 活性剂，这两种表面活性剂首先能够对GLDH也能够起到一定的作用，另外这两种表面活性 剂能够较好的提高生化试剂的重复性。
[0007] 本发明的技术方案如下：一种灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，包括试剂1 (Rl)和试剂2 (R2)，其组分分别如下： 试剂I (Rl): CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（ρΗ=8· 4, 25°C ) 50mmol/L a_ 酮戊二酸 I. 8g/L-2. 4g/L 庆大霉素 0. 2g/L-2g/L ADP. NA 0. 5g/L-lg/L NADH 0. 25mmol/L-〇.5 mmol/L L-亮氨酸 lg/L-2 g/L PEG-6000 lg/L-2 g/L TRITONX -405 lml/L-2 ml/L EDTA lmmol/L-5 mmol/L ； 试剂2 (R2) CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（ρΗ=8· 4, 25°C ) 50mmol/L 庆大霉素 0. 2g/L-0. 5 g/L 氯化铵 0· 2 mol/L-0. 5 mol/L。
[0008] 本发明的创新之处如下： 1) 本发明为双试剂方法检测血清和血浆中GLDH的含量； 2) 在试剂Rl中优先选择了 CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液作为基础缓冲液 这种缓冲液在pH为8. 6-10. 0范围内有较好的缓冲能力，液缓冲能力强，非常适合整个反应 的进行； 3) 本发明在试剂Rl中加入了 GLDH激活剂激L-亮氨酸，从而放大了 GLDH酶类的活 性，使谷氨酸脱氢酶在非常低的浓度下也能够检测出，同时还在Rl试剂中添加了 PEG6000 和TRIT0NX-405这两种表面活性剂，这两种表面活性剂首先能够对GLDH也能够起到一定的 作用，另外这两种表面活性剂能够较好的提高生化试剂的重复性。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0010] 实施例1 本实施例描述的是一种市面上现有的常见的GLDH检测试剂配方： 试剂I (Rl): 三乙醇胺缓冲液（PH=8. 0) 50mmol/L a_酮戊二酸 I. 8g/L ADP. NA 0. 589g/L NADH 0. 25mmol/L EDTA. na2 Immol/L 试剂2 (R2) 氯化铵 0. 2 mol/L。
[0011] 实施例2: 本实施例是描述的是一种灵敏度高的GLDH检测试剂： 试剂配方：本配方为双试剂 试剂I (Rl): CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（ρΗ=8· 4, 25°C ) 50mmol/L a_酮戊二酸 I. 8g/L 庆大霉素 〇. 2g/L ADP. NA 0. 589g/L NADH 0. 25mmol/L L-亮氨酸 lg/L PEG-6000 lg/L TRITONX -405 lml/L EDTA lmmol/L ； 试剂2 (R2) CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（ρΗ=8· 4, 25°C ) 50mmol/L 庆大霉素 〇. 2g/L 氯化铵 0. 2 mol/L。
[0012] 实施例3: 本实施例描述的是一种原材料增加后的灵敏度高的GLDH检测试剂： 1) 试剂配方：本配方为双试剂 试剂I (Rl): CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（ρΗ=8· 4, 25°C ) 50mmol/L a_酮戊二酸 2. 4g/L 庆大霉素 2g/L ADP. NA lg/L NADH 0. 5 mmol/L L-亮氨酸 2 g/L PEG-6000 2 g/L TRITONX -405 2 ml/L EDTA 5 mmol/L ； 试剂2 (R2) CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（ρΗ=8· 4, 25°C ) 50mmol/L 庆大霉素 0. 5 g/L 氯化铵 0. 5 mol/L ; 2) 校准品和质控品： 校准品：朗道复合标准（794UN)其中GLDH的含量为16U/L ; 3) 试剂检测的灵敏性验证具体操作方法： 首先建立 10 个浓度分别为 〇· I U/L、0. 5U/L、1U/L、2U/L、4U/L、8U/L、12U/L、15U/L、 20U/L、30U/L不同浓度的GLDH样本，将这个十个样本分别使用实施例1、实施例2、实施例3 中三个不同的实施例中的试剂配方，结合全自动生化分析仪器(东芝120)，分别同时对这些 样本进行检测，记录检测结果，并对检测结果进行分析； 表1 GLDH检测试剂检测参数
【主权项】
1. 一种灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，其特征包括：本配方为双试剂其中试剂 I (Rl)： CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（pH=8. 4, 25°C ) 50mmol/L a_ 酮戊二酸 I. 8g/L-2. 4g/L 庆大霉素 0. 2g/L-2g/L ADP. NA 0. 5g/L-lg/L NADH 0. 25mmol/L-〇.5 mmol/L L-亮氨酸 lg/L-2 g/L PEG-6000 lg/L-2 g/L TRITONX -405 lml/L-2 ml/L EDTA lmmol/L-5 mmol/L 试剂R2 CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（pH=8. 4, 25°C ) 50mmol/L 庆大霉素 0. 2g/L-0. 5 g/L 氯化铵 0? 2 mol/L-0. 5 mol/L。
2. 根据权利要求1所述的灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，其特征在于，所述试 剂中包括：试剂I (Rl): CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（pH=8. 4, 25°C ) 50mmol/L a_酮戊二酸 2g/L 庆大霉素 lg/L ADP. NA 0. 75g/L NADH 0. 3 mmol/L L-亮氨酸 1/L PEG-6000 12g/L TRITONX -405 Iml /L EDTA Immol/L 试剂R2 CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液（pH=8. 4, 25°C ) 50mmol/L 庆大霉素 0. 5 g/L 氯化铵 0. 5 mol/L 。
3. 根据权利要求1所述的灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，其特征在于，所述试 剂中所米用的缓冲液为CHES (N-环己基-2-氨基乙磺酸）缓冲液。
4. 根据权利要求1所述的灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，其特征在于，所述试 剂中所采用的防腐剂为庆大霉素。
5. 根据权利要求1所述的灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，其特征在于，所述试 剂中所采用激活剂为L-亮氨酸。
6. 根据权利要求1所述的灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，其特征在于，所述试 剂中所采用表面活性剂为PEG-6000和TRITONX -405。
【专利摘要】本发明涉及一种灵敏度高的连续检测法GLDH检测试剂，采用双试剂方法检测血清和血浆中GLDH的含量，其组分分别为：试剂 R1 由CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)缓冲液、a-酮戊二酸、庆大霉素、ADP.NA、NADH、L-亮氨酸、PEG-6000、TRITONX -405、EDTA组成；试剂R2 由CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)缓冲液、庆大霉素、氯化铵组成。本发明通过对原有试剂的缓冲液体系、酶活性保持等方面的改进，使检测试剂的灵敏度、准确度有了显著的提高。
【IPC分类】G01N33-573
【公开号】CN104807995
【申请号】CN201510240865
【发明人】谭柏清, 罗维晓, 甘宜梧, 王绮, 包兴艳
【申请人】山东博科生物产业有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月13日