] 3)柱温对化合物检测的影响
[0141] 其他质谱及色谱条件相同，柱温2〇°c、3〇°c、4(rc时，视黄醇与其乙酸酯视黄醇的 分离度分别为1. 70,1. 48和1. 24,随着柱温的升高，分离度逐渐降低，各分析物离子强度逐 渐增加（图4)。考虑到定量分析首先需要化合物的良好分离，因此选择20°C的作为分析的 适宜柱温。
[0142] 4)APCI/ESI离子源的选择
[0143] 在APCI离子源作用下，视黄醇的信号显著强于ESI离子源检测的信号（p < 〇. 05)，而视黄醇乙酸酯、棕榈酰酯及d6-视黄醇乙酸酯的信号则弱于ESI离子源检测的 信号（P<〇. 05)(详见图5)，β-胡萝卜素可能浓度较低，经两种离子源作用后离子强度无 显著性差异（Ρ > 〇. 05)，提示APCI离子源对视黄醇检测的灵敏度高，ESI离子源对视黄醇 酯类灵敏度高。由于血液中视黄醇浓度高于其他三种前体，且VAD诊断标准主要针对视黄 醇，因此选用对视黄醇检测更敏感的APCI离子源作为本实验的离子源。
[0144] (3)视黄醇及其前体的萃取方法的优化
[0145] 1)血片溶解的研宄
[0146] 加入去离子水溶解干血斑后，提取的视黄醇及乙酸酯、棕榈酰酯、胡萝卜素 分别是不加入去离子水的色谱峰面积的7. 8,1. 8,1. 2,1. 8倍，尤以视黄醇增加显著（ρ < 0. 05)，因此从干血斑中提取视黄醇及其前体时，加入去离子水进行溶解后提取效率更 高。（图6)。
[0147] 2)萃取试剂的选择
[0148] 干血斑中视黄醇经正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷分别萃取后测得的色谱 峰面积依次增加，视黄醇乙酸酯和棕榈酰酯分别经正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯 萃取后所测得的峰面积依次减少。由于主要优化干血斑中视黄醇萃取的条件，且乙酸乙酯 萃取后吹干时间过长，不利于临床快速检测，因此选择三氯甲烷作为萃取试剂。三氯甲烷 100 μ 1，300 μ 1，500 μ 1，700 μ 1分别萃取干血斑中视黄醇及其前体，用量300 μ 1时，视黄 醇及其前体色谱峰面积最大（图7)，提示三氯甲烷300 μ 1对干血斑（3个Φ 3. 2mm)视黄醇 及其前体提取效果最好，遂以三氯甲烷300 μ 1作为后续实验所用萃取试剂。
[0149] 3)蛋白沉淀试剂的选择
[0150] 分别用常见的有机溶剂甲醇、乙醇和乙腈变性、沉淀干血斑中蛋白质后，获得的视 黄醇及其乙酸酯峰面积逐渐减少，β -胡萝卜素的峰面积变化无显著性差异（Ρ > 0. 05)， 视黄醇棕榈酰酯经乙腈作用后峰面积最大（图8)，因此选甲醇为最佳蛋白沉淀试剂。以 50 μ 1，100 μ 1，150 μ 1，200 μ 1甲醇分别作用于干血斑后，视黄醇及其前体峰面积逐渐增 加，提示甲醇200 μ 1效果最好，遂以甲醇200 μ 1作为本实验所用萃取试剂。
[0151] 以含有0. 1 % BHT及0. 025mmol/L KOH的甲醇200 μ 1变性沉淀蛋白质， CHCL3300 μ 1萃取标准品混合液中的视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯和β -胡萝卜素，其萃取 效率分别为 84%，97%，81%，93%。
[0152] (4)HPLC_MS/MS定量方法的构建：视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β -胡萝卜素标 准曲线见图9。
[0153] 2. (1)基质效应
[0154] 本实验检测干血斑中视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、β -胡萝卜素的基质效应分别 为98. 0 %，96. 7 %，90. 0 %和82. 1 %，提示本方法检测视黄醇及其前体，基质效应小。
[0155] (2)线性范围、最低检测限和最低定量
[0156] 采用内标法，绘制视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、胡萝卜素的标准曲线，拟合 线性方程分别为：y = 4· 33Χ10-5χ+0· 0681 (r = 0.9998)，y = 13. 2Χ10-5χ+0· 0542 (r = 0.9937)，y = 5.5Xl(T5x+0.0178(r = 0.9976)，y = 6.74Xl(T5x+0.0376(r = 0.9981)，线 性关系良好（线性相关系数r接近I)。其最低检测限分别为16. 2ng/ml，5. 3ng/ml，6. 3ng/ ml，53. 75ng/ml，最低定量限分别为 65ng/ml，21. 3ng/ml，25. 0ng/ml，53. 75ng/ml。由于本方 法仅用于痕量视黄醇及其前体的检测，因此未检测高浓度标准品，未考察高浓度区域的线 性范围。
[0157] (3)准确性评价
[0158] 本实验对视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、胡萝卜素均有稳定的回收，其回收率 均值分别为 85. 5%，84. 5%，83. 5%和 73. 5%
[0159] (4)精密度评价
[0160] 视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、胡萝卜素批内精密度分别为4. 30%，4. 45%， 4. 35%和7. 35%，连续5d检测的批间精密度分别为6. 70%，4. 9%，4. 85%和9. 40%。
[0161] (5)与传统HPLC方法测定血清视黄醇结果的相关性：见图10。
[0162] 采集50例6月-70月儿童末梢血，约10 μ L，滴注于Whatman 903"滤纸片制成干血 滤纸片，(TC递送至实验室，保存于_20°C冰箱中。利用本发明的方法测定50例6月-70月儿 童干血滤纸片中视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯、β-胡萝卜素浓度的范围分别为 0· 19 μ g/ml-O. 96 μ g/ml (0· 48±0· 16 μ g/ml)，0· 04 μ g/ml-O. 28 μ g/ml (0· 115±0· 06 μ g/ ml)，0· 02 μ g/ml-0.0 6 μ g/ml (0· 02±0· 01 μ g/ml)，0· 03_0· 06 μ g/ml (0· 19±0· 11 μ g/ ml) 〇
【主权项】
1. 一种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤： (1) 从样品中萃取视黄醇和/或其前体； (2) HPLC分离视黄醇和/或其前体； (3)MS/MS定量检测； 所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。2. 如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述萃取步骤包括蛋白变性步 骤，采用试剂为含有0. 1%BHT和0. 025mmol/LKOH的甲醇。3. 如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述从样品中萃取视黄醇和/或 其前体包括以下步骤： ① 血片溶解：将载有微量血的干血滤纸片用打孔器打出直径3. 2mm圆形滤纸血片，置 于1.5mlEP管中，加入lOOyl含0. 1%BHT作为抗氧化剂的去离子水，室温振摇，lOOOrpm， 2min，充分溶解血液； ② 蛋白变性：取步骤①所得血斑标本，加入200yl含有0. 1%BHT和0.025mmol/LK0H 的甲醇变性沉淀蛋白质，游祸震荡2min; ③ 萃取：以300y1三氯甲烷作为萃取剂加入步骤②所得的溶液中，室温振摇2min，离 心 13200rpm，8min; ④ 吸取底层的有机溶剂层180yl，氮气吹干，加入100yl流动相充分溶解，用于 HPLC-MS/MS检测。4. 如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述HPLC分离视黄醇和/或其前 体步骤中，采用C8色谱柱，甲醇：CH2CL2=95:5 (v/v)为流动相，以0. 2ml/L等度流速，保持柱 温20°C进行液相分离。5. 如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，所述MS/MS定量检测步骤中，以 APCI离子源作为离子源；MRM质谱检测参数采用表1所示； 表1〇6. 如权利要求1所述的检测视黄醇及其前体的方法，通过MultiQuant2. 0. 2软件，以 峰面积积分法对MS/MS定量检测数据进行分析，计算峰面积，完成HPLC-MS/MS定量检测数 据的收集；以d6-视黄醇棕榈酰酯为内标，以普通标准品与内标的峰面积比为纵坐标，以普 通标准品与内标的浓度比为横坐标绘制标准曲线，构建HPLC-MS/MS内标定量分析方法。
【专利摘要】本发明提供了一种检测视黄醇及其前体的方法，包括以下步骤：（1）从样品中萃取视黄醇和/或其前体；（2）HPLC分离视黄醇和/或其前体；（3）MS/MS定量检测；所述样品是干血滤纸片标本，采用的萃取剂为三氯甲烷。本发明利用滤纸片作为载体吸附微量血，制成干血滤纸片，克服了以往收集血清检测视黄醇时静脉血采集时取血多，人群依从性差，动物模型抽血死亡，标本不方便远距离运送等困难。本发明基质效应小、在标准曲线中的浓度范围内分析的线性关系良好、检出限较低、灵敏度高、准确性好、精密度高，与HPLC方法检测血清视黄醇结果具有相关性，并同时同步分析样品中视黄醇及其前体含量，为全面评估体内视黄醇水平提供了方法。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN104914176
【申请号】CN201510232220
【发明人】李廷玉, 苗静琨, 邹琳, 余加林, 杨亭
【申请人】重庆医科大学附属儿童医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月8日