细胞图像的归类方法
【专利说明】细胞图像的归类方法
[0001]本申请是以下申请的分案申请:申请日:2007年8月30日；申请号:200780032919.7 (PCT/US2007/019045);发明名称:同上。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请是2006年9月5日提交的美国临时申请N0.60/842，405的非临时申请，通过参照将其并入本文，并要求其部分优先权。
发明领域
[0004]本发明整体上涉及图像分析。图像，例如循环肿瘤细胞是从流式细胞计量术或荧光显微术获得的，并且根据它们的物理性质进行归类。
[0005]发明背景
[0006]许多临床医生相信癌症在其早期是器官局限性疾病。然而似乎这种观点是不正确的，并且在被使用目前可以利用的方法首次检测到时，癌症通常是系统性疾病。有证据证明原发癌在出现临床表现之前的疾病早期开始脱落瘤细胞进入循环。在肿瘤血管化之后，月中瘤细胞脱落进入循环可能会附着到远距离的位点并形成集落，以形成转移。这些循环肿瘤细胞(CTC)含有通常在健康个体细胞中无法发现的标记物，因此形成了诊断和治疗具体癌症的基础。因此，在循环中肿瘤细胞的出现可以代替其他测试或与其他测试结合例如乳房X线照相术或PSA测量，用于筛选癌细胞。通过采用适当的针对革E细胞上或革E细胞中相关标记物的单克隆抗体，或者通过使用细胞蛋白质表达的其他检验，或者通过分析细胞mRNA，容易测定这些细胞的来源器官例如乳房癌、前列腺癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌或其他非造血系统癌症。
[0007]因此，在能够检测癌细胞的情况中，尽管基本上没有肿瘤的临床征兆，但仍可能鉴定它们的存在以及来源器官。此外，根据临床数据，癌症需要被认为是经血液传播的疾病，其特征在于存在潜在非常有害的转移细胞，从而进行治疗。在完全没有可检测的CTC证据的情况中，例如在外科手术之后，可以从进一步的临床研宄确定是否需要后续治疗例如辐射、激素治疗或化学治疗。考虑到这些治疗的成本，预测患者对这类治疗的需要，或者其效率将是重要并且有利的临床信息。同样清楚的是循环中肿瘤细胞的数目涉及疾病从疾病的开始到其最终阶段发展的阶段。
[0008]恶性肿瘤的特征在于它们侵入邻近组织的能力。通常，直径Imm的肿瘤被血管化，并且动物研宄显示在24小时内肿瘤中所存在的细胞中有几乎4%能够脱落进入循环(Butler，TP&Gullino PM, 1975Cancer Research 35:512-516)。肿瘤的脱落能力最有可能依赖肿瘤的攻击性。尽管肿瘤细胞以连续的方式脱落进入循环，但相信没有或者仅有很少的一部分会引起长距转移(Butler&Gullino，同前)。肿瘤质量的提高被认为可能与循环肿瘤细胞频率的提高成比例。如果发现事实如此的话，则具有高水平灵敏性的方法将有助于评价患有长距转移的患者以及患有局部疾病的患者中的肿瘤负荷。在患有局部疾病的患者的外周血液中检测肿瘤细胞不仅具有检测早期肿瘤的潜力，而且还提供了关于肿瘤潜在入侵能力的指不。
[0009]类似地，可分类瘤细胞(classifiable tumor cell)中假象降低以及相应的干扰性可染色碎片对通过显微镜成像检测循环肿瘤细胞有不利影响。因此，维持血液样本的完整性或质量是最重要的，因为在血液提取和样本处理之间存在几乎24小时的延迟。这些延迟被认为是因为在用于该检验的处理血液中所使用的技术和设备可能无法在每个实验室中容易得到。用于使样品到达实验室进行样品处理所必要的时间可能会显著地变化。因此，重要的是建立样品可以被处理的时间窗口(timewindow)。在常规的血液学分析中，可以在24小时内分析血液样品。然而，由于稀有血细胞的分析是更重要的，因此血液样品能够被分析的时间段较短。
[0010]例子是血液细胞的免疫表型分析，其通常必须要在24小时内进行。在癌细胞检验中，需要处理较大体积的血液，血液样品的降解可能变得更有问题，因为来自CTC和来自造血细胞的破碎细胞所释放的材料会提高背景，并因此降低了检测肿瘤细胞的能力。大量CTC能够持续地从肿瘤位点脱落，并且维持了稳态水平，其中CTC的瓦解等于脱落速度，而脱落速度则依赖于肿瘤负荷的尺寸(参见JG Moreno等人“在转移性前列腺癌症患者中的循环癌细胞的变化与疾病状态相关.” Urology 58.2001)
[0011]通常，抗性和增殖能力更强的细胞会存活，以建立次级或转移位点。在外周循环中，CTC被激活的嗜中性粒细胞和巨噬细胞在体内(以及还有体外)进一步攻击，这渐进地导致膜穿孔、泄露电解质、小分子和最终损失对于细胞生存能力必要的重要细胞成分包括DNA、染色质等。在细胞死亡的关键点，细胞凋亡进一步辅助了细胞瓦解。细胞凋亡的特征在于一系列逐步缓慢的细胞内事件，这与由于细胞外物质例如细胞毒性抗肿瘤药物所激发或介导的细胞坏死或者快速细胞死亡不同。这些瓦解过程的全部或者某些可能会导致形成碎片和/或聚集体，其包括来自破碎的CTC以及来自正常造血细胞的偶然瓦解的可染色DNA、DNA片段和“DNA梯度”结构。，因为大部分细胞毒性药物是以接近毒性剂量给药的。
[0012]在该特定技术领域中已知多种方法用于从血液回收肿瘤细胞。例如授予AmCell和Miltenyi的美国专利#6，190，870教导免疫磁性分离，接着进行流式细胞计量术计数。然而，在免疫磁性分离之前，血液样品被使用密度梯度进行预处理。其也没有对样品的可视化分析。
[0013]在授予Immunivest的美国专利#6，365, 362中，描述了用于免疫磁性富集和分析样品得到血液中肿瘤细胞的方法。这些方法具体地针对分析原始细胞，其中细胞的数目与疾病状态相关。所分离的细胞被标记以分析核酸和其他标记物的存在，这能够在分析的过程中排除非靶样品组分。
[0014]其来源组织的上皮细胞服从所建立的生长和发育“规则”。这些规则包括群体控制(populat1n control)。这意味这在正常情况下，细胞的数目和尺寸保持稳定，只有在生物体的正常生长和发育时变化才是必要的。只有上皮细胞的基底细胞或永生细胞才会分裂，并且只有在对于上皮细胞发挥其功能必要时才会分裂，无论怎样都依赖于上皮细胞的性质和位置。在某些异常但良性的情况下，细胞会增殖，基底层会比通常分裂得多，这造成了增生。在某些其他异常但良性的情况下，细胞的尺寸会增大到超过对于特定组织的正常尺寸，造成细胞巨大症，例如在叶酸缺乏症中。
[0015]上皮组织还可能由于恶性前或恶性损伤而导致细胞尺寸或数目的提高。在这些情况中，与上述类似的变化伴随着细胞核异常，其从温和的低度内皮损伤到严重的恶性。相信这些细胞中的变化会影响上皮细胞的部分厚度，并且随着严重性的提高，它们将包括这些上皮细胞更厚的部分。这些细胞不遵守接触抑制的限制，并且继续生长而没有组织控制。当上皮细胞的整体厚度受到恶性变化的影响时，该条件被称作原位癌(CIS)。
[0016]随着它们恶性能力的提尚，恶性细胞最终能够通过基底I旲并侵入器官的基质。在侵入基质后，这些细胞被认为具有达到血管的能力。一旦它们渗透进血管，恶性细胞会发现它们处于与其发源的环境不同的环境。
[0017]这些细胞可以作为单个细胞或者两个或更多细胞的团块渗入血管。循环通过循环系统的上皮起源单细胞注定具有两种结果之一。其可能死亡或者可能存活。
[0018]发明简述
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