19]本发明中所描述的方法用于分析循环肿瘤细胞(CTC)的图像。图像可以是从多种平台获得的，包括多参数流式细胞计量术、CellSpotter荧光显微术成像系统和CellTracks分析仪(CellTracksAnalyzer)。接着根据各种性质对这些细胞进行归类，并以最有可能到可能性最小阳性CTC事件的顺序呈递给用户。本文描述了用于诊断、监控和筛选疾病的方法，其基于循环的稀有细胞，包括通过CTC所确定的恶性。
【附图说明】
[0020]图1显示阳性CTC事件的图像。
[0021]图2显示在同样框架中具有白细胞的阳性CTC事件的图像。
[0022]图3显示在同样框架中具有多个白细胞的阳性CTC事件的图像。
[0023]发明详述
[0024]在本文中，使用被本领域技术人员充分理解的各种术语。这些术语的期望含义不离开所公认的含义。
[0025]术语“生物样本”或“生物样品”可以互换使用，并且指的是从怀疑含有目的细胞的人类对象提取并进行分析的一小部分流体或组织。生物样本指的是流体部分、细胞部分和含有可溶材料的部分。生物样本或生物样品包括但不限于体液例如外周血、组织匀浆液、乳头抽吸液、结肠灌洗液、唾液、吸气管灌洗液、以及可以从人类对象获得的任何其他细胞来源。示范性组织匀浆液可以从乳癌患者中的前哨淋巴结(sentinel node)获得。
[0026]术语“稀有细胞”在本文中被定义为正常情况下不在生物样品中存在，但可以作为异常条件例如感染疾病、慢性疾病、损伤或怀孕指示存在的细胞。稀有细胞还指正常情况下可以存在于生物样品中，存在于生物样品中，但存在频率比正常生物样品中通常存在的细胞低几个数量级的细胞。
[0027]术语“决定簇”在用于任何前述革E生物体(target b1entity)时，宽广地指在通常诱导免疫应答的大分子抗原上存在的化学嵌合体(chemical mosaics)。“决定簇”还可以与“表位”可互换地使用。在本文可互换使用的“生物特异性配体”或“生物特异性反应物”可以特异性地结合决定簇。决定簇指的是靶生物体的一部分，其残余和引起、选择性结合特异性结合物质(例如配体或反应物)，其存在对于发生选择性结合是必需的。因此，在基本术语中，决定簇是靶生物体上被具有结合亲和力的抗原、配体和/或反应物在特异性结合对反应中所识别的分子接触区。
[0028]本文所使用的术语“特异性结合对”包括抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、植物凝集素-糖类、核酸(RNA或DNA)杂交序列、Fe受体或小鼠IgG-蛋白质A、抗生物素蛋白-生物素、链亲合素-生物素和病毒-受体相互作用。
[0029]本文所使用的术语“可检测标记”是指任何物质，其直接或者间接通过物理或化学手段的检测或者测量，是在测试样品中存在目标生物体的指示。可以使用的可检测标记的代表性例子包括但不限于下列:根据光吸收、焚光、反射、光散射、磷光或发光性质可以检测的分子或者离子；通过它们的核磁共振或者顺磁性质可以检测的分子或者离子。可以根据光吸收或荧光间接检测的分子组中所包括的是各种酶，其能够使得适当的底物转化(例如从非光吸收转化为光吸收分子，或者从非荧光转化成荧光分子)。可以使用多种通常所使用的平台的任何平台进行分析，包括多参数流式细胞计量术、免疫荧光显微术、激光扫描细胞仪、亮视野基图像分析、毛细管容量、光谱成像分析、手工细胞分析、CellSpotter分析、CellTrack分析以及自动细胞分析。
[0030]短语“基本上排他的”指的是生物特异性配体或生物特异性试剂与其相应靶决定簇之间结合反应的特异性。生物特异性配体和试剂对它们的靶决定簇具有特异性结合活性，而对其他样品组分还可以表现出低水平的非特异性结合。
[0031]在本文中，短语“早期癌症”与“I期”或“II期”癌症是可互换使用的，并且指的是已经被临床确定为器官局限性的。还包括太小而不能被传统方法测定的肿瘤，例如对于乳癌患者的乳房X线照相术，或者对于肺癌患者的X-射线。而乳房X线照相术能够检测具有大约2X 18个细胞的肿瘤，本发明的方法需要从差不多该尺寸或较小的肿瘤检测循环癌细胞。
[0032]在本文中所使用的术语“形态分析”指对象的可视化观察的特征例如尺寸、形状或者某些特征的存在/不存在。为了对形态特征进行可视化，通常将目标进行非特异性染色。
[0033]在本文中所使用的术语“表位分析”指对已经被标记某些表位的目标进行观察。为了可视化表位特征，通常对目标进行特异性染色或者标记。可以将形态分析与表位分析结合，以提供对目标的完整分析。
[0034]在对样品进行分析时，可以对大量图像进行观察，以确定地评估样品。目前，为观察员呈递了所有事件的图像。这些事件的顺序仅仅是通过它们在样品室中的位置来确定的，即开始的图是在获取的开始，最后的图来自获取的终点。必须要独立于其他人对每张图进行观察，以进行自信地确定。因为目标事件是稀有靶细胞，它们的位置将在样品室内随机出现，随后在观察中随机。因此，鉴定所有感兴趣的罕见事件可能需要观察整个样品。
[0035]在进行诊断时，阳性事件的总数目是最重要的结果。在疾病例如癌症中，较大数目的阳性事件决定疾病的严重性。如果已经建立了阳性事件数目的阀值，则实际的数目可能不如确定是否样品超出阀值重要。换句话说，如果样品具有许多阳性事件，并且超过阀值，则样品能够被认为是阳性的，而不需要观察每一单个事件。
[0036]本发明将通过以最有可能到可能性最小满足为鉴定特定事件所建立的标准的顺序呈递结果，而辅助观察者。在观察开始时呈递的某些候选物越多，则观察会越快地做出决定是否样品超出阀值。而且，使用该方法，会有评分，其中在评分之上的事件最有可能是阳性事件，而之下的则不是。
[0037]为了分析图像，观察者使用标准例如图像中对象的尺寸、形状和强度。为了测定事件是否是阳性，观察者使用标准例如对象的相似尺寸，以及对于给定事件的图像重叠的量。在鉴定CTC时，细胞需要是圆形或者卵形。细胞核图像需要比细胞质图像小。细胞核还需要明显地在细胞质周围。图像的强度对于做出决定也是重要的。
[0038]本发明根据标准的样品组对CTC事件进行归类。首先，其鉴定细胞角蛋白阳性事件。接着，对于给定的细胞角蛋白事件，测量与细胞核事件重叠的量。如果这些图像被适当重叠，则确定该事件作为白细胞是阳性还是阴性。当每个事件都经过这些组标准时，最有可能的CTC候选事件获得较高的评分，并且在分析过程中，观察者被呈递基于它们的归类评分的图像。
实施例
[0039]实施例1 CellTracks 分析仪(CellTracks Analyzer)图像归类
[0040]将利用CellTracks分析仪(CellTracks Analyzer)分析的样品使用细胞角蛋白-PE、DAPI和CD45-APC进行染色。对于CTC样品，同样满足细胞标准的藻红蛋白(PE)阳性、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)阳性、别藻蓝蛋白(APC)阴性事件被计数为肿瘤细胞。PE阴性、APC阳性事件被计数为白细胞。然而，存在PE阳性、APC阳性事件的情况。这些被计数为双阳性事件。
[0041]对于细胞角蛋白-PE图像，本发明分析了染色强度等高线(contour)。这些图像中出现的对象的强度可能是有噪音的。细胞角蛋白染色在明显阳性细胞中很少是一致的。对于典型