；35,延胡索酸；36,尿刊酸；37,苹果酸；38,班巧酸； 39, 5-氨基戊酸；40,丙酬酸；41，a-酬戊二酸；42,二甲胺；43,胆盐；44,腺嚷岭；45,肌 巧；46,a-半乳糖；47, 0 -半乳糖；48,尿巧；49, 3-哲基苯己酸；50, 3-哲基苯丙酸；51，乳 酸。
【具体实施方式】
[00測 实施例1
[0029] 1内容物样品
[0030] 21日龄仔猪盲肠内容物样品。
[0031] 2实验设备
[0032] 分析天平（SartoriusBS110S)，德国Sartorius公司；微量加样器，美国Hiermo 公司；酸度计（HANNApH211型），意大利HANNA公司；縱祸振荡器佑k8813型），江苏海 口市其林贝尔仪器制造有限公司；低温冷冻大容量离屯、机（Anke化-4000B型），上海安亭 科学仪器厂；超低温冰箱（SANYO叫1:ralowfreezer)，日本SANYO公司；BrukerAvance DRX-600高分辨核磁共振谱仪，德国化址erBiospin公司。
[003引 3提取方法；
[0034] 称量解冻的胃肠道内容物Ig采用1M化0H溶液和1M肥1溶液将抑值调整到 8.0,然后称取0.Ig混匀的内容物，加入0. 1M磯酸盐缓冲液（100 %重水，TSP内标浓度 为0.01 %，抑值为8.0)1.OmL，液氮速冻后，冰浴锅中超声并解冻后，置于组织破碎仪中 (20化，30s)，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4°C，12000巧m离屯、lOmin，取 上清液0.6血加入5mm核磁管备用。
[0035] 4本发明核磁共振检测方法；
[0036] 采用Amix(V3.8. 3,化址erBiospin,Germany)软件对内容物提取液的咱N犯SY 谱进行自动积分。为了消除残余水峰对分析造成的影响，将水峰所在的5 4. 54-5. 20区间 的积分值去掉。将NMR谱的5 0. 5-4. 54和5 5. 20-8. 5ppm区间的积分值进行归一化处理 (每个区间的积分值与总积分值的比值），积分间隔0.00化pm。随后将归一化的数据导入 SIMCA-P+11.0软件包（Umetrics,Sweden)进行多变量分析。通过主成分分析法对样品的群 体聚类情况进行分析，PCA结果用得分图来表示。
[0037] 5pH值对内容物主要代谢物化学位移的影响评价
[003引采用TopSpin2. 0软件观察并记录内容物中的主要代谢物，如，氨基酸类（亮氨 酸、丙氨酸、组氨酸、甘氨酸等）、有机酸（甲酸、己酸、丙酸、了酸和乳酸等）、葡萄糖（a-葡 萄糖和0 -葡萄糖）的化学位移，研究他们随着抑的变化时的变化幅度。PCA的得分图如 图2所示，由于培养上清的成分一致，导致样品之间的不同聚类主要来至抑值的变化，样品 点之间的距离也就代表了抑值对内容物代谢物化学位移的影响，距离近则影响小，距离远 则影响大。
[0039] 从图2中可知，随着抑值从2. 0变化到12. 0,样品在得分图的PCI维和PC2维表 现为分布的连续变化。如果W得分图上点的距离代表抑值对代谢物化学位移的影响，则可 发现如下变化；从抑值2. 0到抑值6. 5,样品点分布的变化较大，而从抑值7. 0到抑值 8. 5,则变化相对较小，从抑值9. 0到抑值10. 0之间变化又加剧，最后9. 5-12之间变化较 小。而且，在得分图上明显出现两个聚类，即抑值7. 0到抑值8. 5和抑值10. 0到抑值 12. 0 (如图2,虚线楠圆形框所示）。该可能与内容物组成中主要W酸性物质为主有关，酸性 物质在中性和碱性环境中，其核磁谱谱化学位移会比较稳定。
[0040] 因此，本方法中内容物的抑值条件为2. 0-12. 0,更优选8. 0,所述的磯酸盐缓冲液 抑值条件为7. 0-8. 5,更优选8. 0。
[0041] 6不同提取方法之间的提取效率比较
[0042] 6. 1提取溶液与内容物比例的优化
[0043] 由于提取溶液与内容物的比例越大，提取代谢物的效率会越高，但是浓度会降低， 从而增加后期核磁检测的采样次数和时间。在采样次数为64次的前提下，通过核磁共振谱 图比较不同溶剂比例（提取溶液与内容物比例为20 ;1、10 ;1、5 ;1和2. 5 ;1)之间的信噪 比。结果表明，提取溶液与内容物比例最优为10 ;1。
[0044] 6. 2破碎处理方式的优化
[0045] 在提取溶液与内容物比例为10 ;1的基础上，进一步优化破碎处理方式。去除谱图 中的4. 54-5.化pm水峰后，W0. 00化pm的积分区间采用Amix炬ruker,Germany)软件对压 水的N犯SY咱谱的8. 5-5.化pm和4. 54-0. 5ppmW进行自动积分（绝对值），并WTSP的 积分值化〇2ppm至-0. 0化pm)为1进行归一化，W不同提取方法的归一化积分值之和评价 提取效率。冻融、超声和破碎循环次数不同的产量如表1所示，随着循环次数从高至低依次 为；循环4次〉循环3次〉循环2次〉循环1次，说明随着循环次数的增加，提取效率会增 加，循环次数从1次增加到3次，提取效率有显著提高（P<0. 05)，而循环次数从3次增加到 4次，没有明显差异（P〉0. 05)。说明循环3次可W达到最优化循环次数。因此，所述的破碎 处理方式为冻融、超声和破碎1-4个循环，更优选3个循环。
[0046] 表1冻融、超声和破碎循环次数不同之间的产量比较
[0047]
[0049] 注；a,与循环1次相比P<0. 05 ;b，与循环2次相比P<0. 05 ;%与循环3次相比P<0. 05 ;d，与循环4次相比P<0. 05
[0化0] 6. 3重水含量的优化
[0051] 提取磯酸盐缓冲溶液中重水的含量直接与核磁检测过程中的压水的难易程度相 关，水峰面积小时，核磁谱图的质量较高。如图3所示，重水含量为10%和20%时压水峰面 积较大，重水含量为50%时压水峰面积较小，100%时面积最小。因此，提取缓冲溶液中重水 的含量最优选为100%。
[0化2] 6. 4TSP内标含量的优化
[0化3]TSP作为核磁检测过程中的内标物质，其浓度应该与提取液所含物质的浓度相匹 配。如图4所示，从TSP浓度0. 005、0. 01、0. 05到0. 1 %，峰面积成比例增加，而TSP浓度为 0. 005%时，采样次数为64次，谱峰信号较弱。而从图5可看出，TSP浓度为0. 1%时，其谱 峰远远高于样品中的其他物质峰强度。因此，综合W上实验数据，更优选的TSP内标浓度应 为0.01%。
[0化4] 6. 5提取温度的优化
[0055] 对提取液中的主要代谢物，如；氨基酸类（组氨酸、丙氨酸、甘氨酸）、有机酸（乳 酸、甲酸、己酸、丙酸、了酸和戊酸）、葡萄糖（a-葡萄糖和0-葡萄糖）的积分值进行归一 化，比较他们在不同温度（冰上为0-4。室温为25°C)下提取时的变化。PCA的得分图 如图6所示，由于不同温度下内容物中微生物和酶的代谢活性不同，会对最终提取液中的 代谢物成分造成影响，导致样品之间的不同聚类主要来至温度的变化，不同样品出现了明 显的聚类。
[0056] 因此，样品提取时在0-4°C(冰上）和25°C(室温）操作，更优选0-4°C。
[0化7] 7在上述最优化提取方法下得到内容物核磁谱图结果
[0化引仔猪盲肠内容物核磁谱图见图7所示，从盲肠内容物核磁谱图中指认大约51种代 谢物，其中包括20种氨基酸和7种短链脂肪酸。
[0化9] 采用本发明提取方法，不仅保证了胃肠道内容物的代谢物原貌，将核磁谱峰漂移 减小到最低程度，也简化了提取流程，提高了代谢物的提取效率，改善了核磁谱图的质量。
【主权项】
1. 一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 用IM NaOH溶液和IM HCl溶液将解冻的猪胃肠道内容物pH值调整到2. O -12. O ; (2) 取猪胃肠道内容物加入0.1 M或IM的磷酸盐缓冲液中，猪胃肠道内容物与磷酸盐缓 冲液的质量体积比为1:20至1:2,质量体积比的单位为g/mL，经液氮速冻后，于水浴锅中超 声解冻，然后置于组织破碎仪中破碎；将破碎后的猪胃肠道内容物再重复液氮速冻、超声解 冻、破碎仪破碎处理1一3次； (3) 将经步骤（2)处理后的猪胃肠道内容物于4°C、12000rpm离心，取上清液，即为猪胃 肠道内容物的提取物。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中调整后的猪胃肠道内容物的pH 值为8.0。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中猪胃肠道内容物与0.1 M磷酸盐 缓冲液的质量体积比为1:10。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，用水配制步骤（2)所述的磷酸盐缓冲液，所 用的水中重水含量为10 -100 %，所用TSP内标浓度为0. 005-0. 1 %，配制后的磷酸盐缓冲 液的pH值为7.0 - 8.0。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，用水配制步骤（2)所述的磷酸盐缓冲液，所 用的水中重水含量为100%，所用TSP内标浓度为0.01%，配制后的0.1 M磷酸盐缓冲液的 pH值为8.0。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，用甲醇和水混合溶液配制步骤（2)所述的 磷酸盐缓冲液，所用TSP内标浓度为0. 005-0. 1 %，配制后的磷酸盐缓冲液的pH值为7. 0- 8. 0〇7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，用乙腈和水混合溶液配制步骤（2)所述的 磷酸盐缓冲液，所用TSP内标浓度为0. 005-0. 1 %，配制后的磷酸盐缓冲液的pH值为7. 0- 8. 0〇8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑶中是将破碎后的猪胃肠道内容物再 重复液氮速冻、超声解冻、破碎仪破碎处理2次。
【专利摘要】本发明公开了一种猪胃肠道内容物代谢组学提取方法，方法如下：称量解冻的胃肠道内容物1g，采用1M NaOH溶液和1M HCl溶液将pH值调整到8.0，然后称取0.1g混匀的内容物，加入0.1M磷酸盐缓冲液(pH值8.0)1mL，液氮速冻后，水浴锅中超声并解冻，置于组织破碎仪中(20Hz，30s)破碎，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。最后，4℃，5 000rpm离心10min，取上清液0.6mL加入5mm核磁管备用。可检测代谢物51种，其中，氨基酸20种，短链脂肪酸7种，三羧酸循环代谢物5种，其他代谢物19种，整个提取过程仅需3h。谱峰漂移受pH值影响很小。因此，该方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质量，而且简化了提取流程。
【IPC分类】G01N1/28, G01N24/08
【公开号】CN104977200
【申请号】CN201510413732
【发明人】何庆华, 李铁军, 任萍萍, 孔祥峰, 印遇龙, 伍力
【申请人】中国科学院亚热带农业生态研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月15日