循环血miR-34a作为辐射生物标志物在辐射监控中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及福射监控技术领域，尤其设及循环血miR-34a作为福射生物标志物在 福射监控中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，福射的监控通常都使用物理剂量计，但在有些情况下，单纯使用物理剂量计 进行监测难W全面准确地反映福射对每个个体的影响。如动物福照实验研究中，为了减少 操作人员接触福射环境的机会，同时提高照射效率，通常都会使用动物自动传输装置。有时 传输的动物会偏离照射中屯、，发生非均匀照射甚至是脱祀照射的情况，如果采用动物自身 携带的生物分子来确认是否受到照射，不仅可W减少实验动物的废弃，而且可W增加实验 研究结果的可靠性。此外，在意外照射发生时，由于事件的突发性和不确定性，很难准确评 估实际照射情况，此时，如果能采用方便、灵敏的福射生物标志物来判断每个个体是否受到 照射及福射损伤的程度，对于福射风险的准确评估并及时采取适当的措施显得尤其重要。
[0003] 作为重要的遗传物质，DNA的损伤方式和损伤程度与福射的种类和剂量密切相关， 是比较理想的能反映个体受照射程度的生物标志物。因此，淋己细胞染色体崎变、细胞微核 等方法都可W用于福射监测。此外，剂量相关的循环系统中粒细胞和淋己细胞减少、福射敏 感蛋白如淀粉酶、C-反应蛋白、转化生长因子等也可W作为福射生物标志物。但是该些检 测方法都有各自的不足之处，在及时性、便捷性、稳定性和灵敏性上不够理想，如淋己细胞 染色体崎变的观察程序复杂、需要时间较长(一般为2化W上);粒细胞和淋己细胞容易受感 染、炎症等因素的影响；福射敏感蛋白受转录后调控，个体差异大、重复性不好。
[0004] microRNA(miRNA)是一类广泛存在于生物体中、长度约18~25nt的非编码小分 子RNA。它们通过与祀基因的信使RNA(mRNA)序列互补结合来实现基因表达的调节，参与 生物体的生长、发育、细胞分化、细胞调亡等一系列重要的生命过程。循环血中含有丰富的 miRNA,由于分子量小且常常包裹在囊泡里，循环血miRNA很难被RNA酶降解，耐反复冻融及 酸碱环境变化，保证了其能准确反映原初表达水平的可能性。因此，无论在血液中还是在提 取及检测的过程中，miRNA都能稳定存在，从而保证了检测结果的准确性，该些是淋己细胞、 福射敏感蛋白及其它核酸类分子所不能比拟的优点。另外，miRNA在不同物种间具有高度 的保守性，W动物模型得出的研究结果也适宜于人体的借鉴和参考。
[0005] 作为重要的基因转录后水平调控因子，miRNA积极响应于外界环境的改变，在机体 受到外源福射时，其表达也会发生显著改变。如化cob等人的研究（PL0S0肥，2013,8 (2): G57603)发现，小鼠循环血中的miR-150在受到X射线和丫射线全身照射后呈现出明显的 降低趋势，并随剂量和时间的变化呈现出一定规律，该些结果为寻找可作为福射标志物的 循环血miRNA提供了实验和理论支持。值得注意的是，他们选取的照射剂量偏大（l-8Gy)， 且仅限于常见的电磁福射，应用于福射监测在灵敏性和广泛性上还有很大的局限。前期研 究表明，小鼠循环血中与福照相关的miRNA有一百多种，因而有望从该些福射敏感的miRNA 中获得理想的新福射生物标志物，并应用于福射环境下每个个体受照射情况的监控。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种循环血miR-34a作为福射生物标志物在 福射监控中的应用。
[0007] 为解决上述问题，本发明所述的循环血miR-34a作为福射生物标志物在福射监控 中的应用，其特征在于：该循环血miR-34a是指按常规方法从动物或人的血清中提取获得， 其用于非均匀照射或意外照射大于化的条件下判断照射及福射对动物或人的损伤程度。 [000引本发明与现有技术相比具有W下优点： 1、本发明W对福射比较敏感的血液系统为切入点，充分利用miRNA的生物学特点，通 过microRNAPCRArray等方法在循环血中逐步筛查福射相关的miRNA，最终获得了理想 的新福射生物标志物miR-34a。该福射生物标志物在受到不同类型福射的照射后，循环血 miR-34a表达水平明显上升，并且随着照射剂量的增加呈现上升的趋势，与淋己细胞染色体 崎变、粒细胞和淋己细胞减少、福射敏感蛋白等福射生物标志物相比，在及时性、便捷性、稳 定性和灵敏性上都更为优越。
[0009] 采取的福射源为化xitronR650型X射线仪产生的X射线和兰州重离子加速器冷 却储存环（HIRFkCSR)生物福照终端产生的碳离子束（1古6+)。
[0010] (1)福射相关miRNA的筛查；W能量为300MeV/u的碳离子束全身贯穿照射6~8周 的清洁级雄性昆明小鼠（兰州大学医学院提供)，照射剂量为0.5Gy和2.0Gy，每个处理组 6只小鼠，并W未照射小鼠作为对照。照射后24小时取血，提取血清并分离、纯化总RNA，用 miRCURYLNA?UniversalRTmicroRNAPCRArray(Exqion)巧片检测 360 种血清miRNA 的表达变化水平，结果表明；福射处理后表达上升和下降的miRNA总共有一百多种，其中 0. 5Gy处理组表达变化超过2倍的miRNA有20多种，2. 0Gy处理组表达变化超过2倍的 miRNA有30多种。
[0011] 口)候选miRNA确定及其巧片测试：通过分析上一步的广泛筛查结果，选择了 20种可能成为福射生物标志物的miRNA组成了一个集合，W该些miRNA为内容定制PCR (PolymeraseQiainReaction,聚合酶链式反应）巧片。分别用X射线和lOOMeV/u碳离子 束全身注入照射，X射线的剂量为0. 5、2. 0和4.OGy，碳离子的剂量为0. 25和0. 5Gy(注； 碳离子束注入生物样品时，引起的生物效应比较高，因此选择的照射剂量相对较低)。照射 后24小时取血，提取血清并分离、纯化总RNA，进行反转录和miRNAPCRArray巧片检测，结 果再次表明；多个miRNA的表达水平在照射前后都有显著的上升或下降。
[0012] 樹可作为福射生物标志物的miRNA确定；通过W下S个条件对该20种miRNA进行 筛选；福照后变化倍数大于2且显著性检测中P值小于0. 05W保证miRNA变化水平具有显 著性差异；PCR检测中平均Ct值（PCR反应中反应管内的巧光信号达到设定值时所经历的 循环数）小于32W保证miRNA在血清中丰度较高、容易检测。经过筛选之后，从X射线照 射组和碳离子照射组确定出6种可作为福射生物标志物的miRNA,包括miR-34a、let-7a、 miR-223和已经有报道的miR-150。
[0013] (4)循环血miRNA稳定性检测；对该6种可作为福射生物标志物的循环血miRNA的 稳定性作了进一步考察。具体方法如下；选取鼠龄为6周，10周，16周的小鼠，在未经任何 处理的条件下取血清，用巧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测该6种miRNA的本底表达 水平，结果表明；所检测的6种miRNA在不同年龄组别中变化很小，在小鼠血清中稳定存在。
[0014] 脚循环血miR-34a对福射的响应；循环血miR-34a表达水平在X射线和碳离子束 照射条件下都表现出明显的上升趋势；并且在0.5Gy的X射线和0.25Gy的碳离子束注入 照射条件下，miR-34a表达上升明显，约为没有受到照射时的2倍；并且随着照射剂量的增 加，循环血miR-34a表达上升也呈现增加的趋势。表明循环血miR-34a对福射的响应非常 灵敏，完全符合作为福射生物标志物的条件，具体的检测数据结果见表1所示。
[0015] 表1.不同类型的福射处理后，循环血miR-34a表达水平均有提高
做将miR-34a的表达变化和已经有文献报道的miR-150的表达变化作了对比，如表2 所示。W2Gy剂量处理结果为例，miR-34a表达上升了 3