86%而miR-150表达下降了 63% (自测数据）和62% (Jacob等人发表数据)，可W看出；miR-34a的变化幅度比miR-150的变 化幅度更为明显。
[0016] 表2.福射后24小时循环血中miR-34a表达上升与miR-150表达下降的比较
此外，比较福照后不同时间点（6、12、24、48和72小时)，循环血11111?-343表达水平的变 化情况，结果如图1所示，在福照后的6~72小时，miR-34a表达水平均有明显提高，且在48 小时最高，因此，该一特征可W作为常规福照实验研究中判断动物是否受到照射的一种新 方法，W增加实验结果的可靠性。
[0017] 2、由于miRNA在不同物种间具有高度的保守性，W动物模型得出的研究结果也适 宜于人体的借鉴和参考。因此，本发明循环血miR-34a作为物理剂量计测量结果的有益补 充，可用于意外福射事件中人和动物受照射情况的监控，有效提高评估福射风险和福射危 害的准确性。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0019] 图1为本发明小鼠经X射线照射后循环血中miR-34a表达水平随时间推移的变化 趋势（*表示P<〇. 05，**表示p<0. 01，每一时间点均是与对照组化相比较)。
【具体实施方式】
[0020] 循环血miR-34a作为福射生物标志物在福射监控中的应用，该循环血miR-34a是 指按常规方法从动物或人的血清中提取获得，其用于非均匀照射或意外照射大于化的条 件下判断照射及福射对动物或人的损伤程度。
[0021] 其中；福射的种类包括X射线、r射线等电磁福射及电子、质子、碳离子、铁离子等 粒子福射。 实施例
[0022] 用0、0. 5、2. 0和4.OGy的X射线照射小鼠，每个处理组6只小鼠。双盲法进行X 射线照射和循环血miR-34a表达水平检测： 1.血清的提取；在福射事件发生后（6~7化均可)，采集需要鉴定的动物或人的全血至 无RNA酶的EP管中，整个过程避免剧烈晃动，并且不要让杂质落入管中，W防溶血。同时采 集没有照射的动物或人的全血作为对照。将全血在室温下放置比，3000r/min离屯、10分 钟，吸取上层澄清的血清，放入新的无RNA酶管中，10000r/min离屯、10分钟，即可分离得到 检测所需的血清样品，并可储存于-80°C保存。
[002引 2.RNA的纯化：由于血清样品中RNA的丰度较低，可W用QIAGE肥公司的miRNeasy Serum/PlasmaKit试剂盒纯化。在提取之前，加入外源线虫cel-miR-39作为内参，用于PCR反应后数据的归一化处理。具体操作过程如下： C0融化血清样品，加入5倍于样品体积的QIAzolLysisReagent(有毒，有腐蚀性)，祸 旋混匀。如 200ul血清需加入 1mlQIAzolLysisReagent。
[0024] 口)室温下静置 5min，加入 3.加 1cel-miR-39 (1. 6Xl〇8copies/ul)。
[0025] 樹加入和开始样品等体积氯仿，盖上盖子，用力摇晃15s。
[0026](4)在室温下解化 2~3min。4°C，12000r/min离屯、15min。
[0027] 脚移取上清到新的EP管中，并避免吸到任何中间相。加入1. 5倍体积的100%酒 精，吹打混匀。
[0028] (6)最多吸取700ul样本，加入到RNea巧MinElutespincolumn，（用于聚集溶液 中的核酸，试剂盒有提供）。室温，> 8000r/min离屯、Imin，弃掉流出液。
[0029] (7)剩余的样本重复上一步。
[0030] 佩加入 700ulBufferRWT到RNeasyMi址lutespincolumn。室温，> 8000r/ min离屯、30s，弃掉流出液。
[003U佩吸取 500ulBufferR阳到RNeasyMi址lutespincolumn。室温，> 8000r/min离屯、30s，弃掉流出液。
[003引 朋)加入 500ul80% 酒精到RNeasyMi址lutespincolumn。室温，> 8000r/min， 离屯、1. 5min。
[0033] ⑩把RNeasyMi址lutespincolumn放入新的收集管中，满速下离屯、5min，再打开 盖子惊干5min。
[0034] 脚把RNeasyMi址lutespincolumn放入新的 1. 5ml无RNA酶EP管中。将 20 ulRNase-化eewater直接加入到spincolumn膜的中屯、。轻轻关上盖子，满速下离屯、2min 洗提RNA。
[0035] 3.RNA的反转录；义用AU-in-〇neFirst-standcDNASythesisKit(Gene Copoeia)反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA聚合物用于下游的实时巧光定量PCR (qRT-PCR)检测。反应体系如表3 ; 表3
反转录程序为37°C下反应60min，85°C下灭火5min。
[0036] 4.miR-34a引物设计；miR-34a的引物设计可W直接由公司完成，本流程采用的是 GeneCopoeia公司设计和生产的All-in-〇ne?miRNAqPCRPrimer。
[0037] 5.miR-：Ma的qRT-PCR检：;采用AU-in-oneTMmiRNAqRT-PCRDetection Kit(GeneCopoeia)试剂盒进行血清miR-34a的定量检测，具体操作过程如下；融解 All-in-〇nemiRNAqRT-PCRDetectionKit中的2XAU-in-〇neqPCRmix,混匀、短暂离 心后置冰上待用。反应体系如表4 ; 表4
反应程序如表5 ;为保证实验的准确性，每个样本加3个复孔。
[00%]表 5
数据分析；反应所得到的ct值，利用a法进行分析，公式如下； 变化倍数（Foldchange)=2-AAGt，AACt=ACt(q)-ACt(O) 其中，ACt(q)=Ct(q)x-Ct(q)n为待鉴定样品Ct值之差，ACt(0) =Ct(0)x-Ct(0)n为 对照样品Ct值之差，X代表miR-34a的Ct值，n代表线虫cel-miR-39 (内参）的Ct值。 [0039] 结果判定；如果数据分析中的变化倍数大于1. 5,即可判定待鉴定样品的循环血 miR-34a表达水平明显提高。结果表明，各受照射组小鼠的循环血miR-34a表达水平都比未 受到照射组明显提高了 2~4倍，并且随着照射剂量的增加，miR-34a表达水平呈现增加的趋 势。
【主权项】
1.循环血miR-34a作为辐射生物标志物在辐射监控中的应用，其特征在于：该循环血 miR-34a是指按常规方法从动物或人的血清中提取获得，其用于非均匀照射或意外照射大 于6h的条件下判断照射及辐射对动物或人的损伤程度。
【专利摘要】本发明涉及一种循环血miR-34a作为辐射生物标志物在辐射监控中的应用，该循环血miR-34a是指按常规方法从动物或人的血清中提取获得，其用于非均匀照射或意外照射大于6h的条件下判断照射及辐射对动物或人的损伤程度。本发明循环血miR-34a作为物理剂量计测量结果的有益补充，可用于意外辐射事件中人和动物受照射情况的监控，有效提高评估辐射风险和辐射危害的准确性。
【IPC分类】G01N33/49
【公开号】CN104977398
【申请号】CN201510333137
【发明人】王菊芳, 危文俊, 王洁, 丁楠, 何进鹏
【申请人】中国科学院近代物理研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月16日