区在下表面上包括三个电极，其每个均接触所述唾液滴， 并且每个均与导线（lead)连接以提供信号至图IB中所示的信号调节电子模块。经调节的 信号继而被传递至图IC中所示的微控制器模块，其可进行计算，分析数据，以及存储数据 或将其传送至外部接收器（未显示）。
[0027] 图2A是本发明唾液葡萄糖传感器的电极部分20的实施方式的示意图。工作电极 30、参比电极32、和反电极34平行放置，每个均延伸至样品区22内，样品区22中存放唾液 并且唾液与三个电极中的每个均接触。所述工作电极延伸至所述样品区内，在此其形成样 品接触片（contact pad) 26。工作电极的一部分24 (包括样品接触片）涂覆有本发明的葡 萄糖检测涂层。图2B显示了按照图2A中所示布局所构建的实际传感器的图片。
[0028] 图3A显示了将SWNT功能化用于葡萄糖检测过程的实施方式的示意图。功能化是 通过用所示结合机制施加涂层来实现的。图3B显示了根据图3A制造的唾液葡萄糖传感器 的横切面。传感器的层显示如下：10-绝缘或半导体基材（例如，硅或陶瓷材料）；11-导 电金属层（例如，铂）；12-PAA层；13-SWNT层；14-壳聚糖层（CS) ;15_金纳米颗粒层 (GNp);和16 -葡萄糖氧化酶层（GOx)。
[0029] 图3C显示了将SWNT功能化用于葡萄糖检测过程的实施方式的示意图。功能化是 通过用所示结合机制施加涂层来实现的，其中基材具有SWNT所结合的带正电的表面。图3D 显示了根据图3C制造的唾液葡萄糖传感器的横切面。传感器的层显示如下：10-绝缘或半 导体基材（例如，硅或陶瓷材料）；11 -导电金属层（例如，铂）；13-SWNT层；14-壳聚糖 层（CS) ; 15 -金纳米颗粒层（GNp);和16 -葡萄糖氧化酶层（GOx)。
[0030] 图3E显示了将SWNT功能化用于葡萄糖检测过程的实施方式的示意图。功能化是 通过用所示结合机制施加涂层来实现的，其中基材的表面具有SWNT所结合的粗糙材质。图 3F显示了根据图3E制造的唾液葡萄糖传感器的横切面。传感器的层显示如下：10-绝缘或 半导体基材（例如，硅或陶瓷材料）；11 -导电金属层（例如，铂）；13-SWNT层；14-壳聚 糖层（CS) ; 15 -金纳米颗粒层（GNp);和16 -葡萄糖氧化酶层（GOx)。
[0031] 图3G显示了将SWNT功能化用于葡萄糖检测过程的实施方式的示意图。功能化 是通过用所示结合机制施加涂层来实现的，其中所述涂层不包括传感器元件（SWNT)，并且 含有壳聚糖、金纳米颗粒、和葡萄糖氧化酶的涂层被直接施加于所述基材。图3H显示了根 据图3G制造的唾液葡萄糖传感器的横切面。传感器的层显示如下：10-绝缘或半导体基材 (例如，硅或陶瓷材料）；11_导电金属层（例如，铂）；14_壳聚糖层（CS) ;15_金纳米颗 粒层（GNp);和16 -葡萄糖氧化酶层（GOx)。
[0032] 图4显示了本发明葡萄糖传感器的微流控实施方式的概略图。
[0033] 图5A显示了使用电子束沉积唾液葡萄糖传感器进行的葡萄糖水平监测。图5B显 示了使用自由式血液葡萄糖计进行的葡萄糖水平监测。显示了对象A在指定时间摄入葡萄 糖耐受饮料之前和之后的数值。
[0034] 图6A显示了使用丝网印刷（screen printed)的唾液葡萄糖传感器进行的葡萄糖 水平监测。图6B显示了使用自由式血液葡萄糖计进行的葡萄糖水平监测。显示了对象B 在指定时间摄入葡萄糖耐受饮料之前和之后的数值。
[0035] 图7A显示了使用丝网印刷的唾液葡萄糖传感器进行的葡萄糖水平监测。图7B显 示了使用自由式血液葡萄糖计进行的葡萄糖水平监测。显示了对象C在指定时间摄入葡萄 糖耐受饮料之前和之后的数值。
[0036] 图8A显示了使用丝网印刷的唾液葡萄糖传感器进行的葡萄糖水平监测。图8B显 示了使用自由式血液葡萄糖计进行的葡萄糖水平监测。显示了对象D在指定时间摄入葡萄 糖耐受饮料之前和之后的数值。
[0037] 发明详述
[0038] 本发明提供了无痛测试方法，其中使用了适宜于检测唾液样品中葡萄糖的高度灵 敏的葡萄糖传感器和相关电化学系统。本发明的唾液葡萄糖传感器适宜用于在任何情形下 (包括家用或者诊所）筛查和诊断糖尿病，以及由个体糖尿病患者或测试对象来监测葡萄 糖控制，其中仅使用少量的未经修饰的人类唾液，并且在几秒内获得结果。
[0039] 本发明通过使用本文所示葡萄糖传感器来实时测定唾液葡萄糖水平。本发明的目 标是测定唾液中的少量葡萄糖。本发明可以在很多应用中取代目前的血液葡萄糖监测仪， 因为其是非侵入性的并且易于使用且不会带来疼痛、不安、或焦虑。其对唾液葡萄糖的生理 变化（与血液葡萄糖的变化并行）敏感，因而可有效用于通过唾液在任何时候实时追踪葡 萄糖水平，包括根据医师的指示以规定的间隔或在规定时间进行，在家、在工作、或者在旅 行的时候进行。
[0040] 本发明的唾液葡萄糖传感器可用作实时非侵入性唾液葡萄糖监测系统的一部分。 实时系统含有唾液取样机构、基于酶的电极生物传感器、葡萄糖计、信号处理组件、以及用 于输出结果的显示器。实时唾液取样机构任选可包括用于从口腔收集唾液的收集器以及唾 液过滤和/或唾液预处理模块，其可增强取样的可靠性和结果的准确性。所述生物传感器 是电化学系统，其可在单个芯片上包括三电极或四电极电池。单个芯片或基材上可包括多 个相同或不相同的传感器，从而能够以增强的可靠性和/或以多元的形式来进行测定。
[0041] 一个实施方式包括作为涂层被施加于工作电极的单壁碳纳米管（SWNT)。所述 SWNT可以例如是，金属和半导体SWNT的混合物。所述SWNT提供了极大的表面积-体积比 并且具有有用的电学特性。本发明的传感器通过电化学机制运行，其中特定分析物的存在 会引起电化学系统中的电子转移，这可以测定通过所述传感器的电流来鉴别和定量，所述 电流可通过电流分析（amperometry)转化为输出电压。所述传感器的此特征使得其比其它 类型的传感器（在存在分析物时产生SWNT电阻的改变）更加准确和可靠。
[0042] 所述电极材料可包含或者由以下组成：例如但不限于，金、铂、铱、银、银/氯化银、 铜、铝、铬、或者其它导电金属或导电材料、或者其任意组合。在一个实施方式中，用涂层 将所述SWNT功能化，所述涂层包括催化电子转移反应的酶并且特异于选定的分析物如葡 萄糖。优选所述反应是氧化反应。例如，对于葡萄糖作为分析物的检测，可以使用葡萄糖 氧化酶（GOx，EC I. 1. 3. 4)，其特异性地催化将β -D-葡萄糖氧化成过氧化氢和D-葡萄糖 酸-δ-内酯，其继而水解成葡萄糖酸。所述酶可以是天然存在的葡萄糖氧化酶，其分离自 天然来源（例如，黑曲霉菌（Aspergillus niger)细胞），或者所述酶可以是在转化的或转 染的细胞（如细菌细胞、酵母或真菌细胞、或者哺乳动物细胞）中重组产生的。其可以是糖 基化的或非糖基化的。所述传感器中使用的葡萄糖氧化酶可以具有天然存在的氨基酸序 列，或者其可以具有突变的或者经改造的氨基酸序列。经不同的酶功能化的SWNT可以组合 于多元传感器中，该传感器可利用每种酶的不同灵敏性以及其对唾液样品中可能遇到的潜 在干扰物质所引起的抑制的不同抗性。
[0043] 所述传感器检测唾液或其他液体中的葡萄糖水平，其通过持续追踪通过所述工作 电极上涂覆的葡萄糖氧化酶的电子并测量所产生的电流，所述电流由电流分析检测电路检 测并表示为输出电压的改变。可以通过用各种材料修饰酶涂覆的电极来进一步改善传感性 能，包括生物分子薄膜或膜或者多孔薄膜或者膜。此类材料包括但不限于，碳纳米管、石墨、 纳米线、金纳米颗粒（GNp)、Pt纳米颗粒、壳聚糖、牛血清白蛋白（BSA)、以及普鲁士蓝，或者 其它具有类似性能的材料。在一个实施方式中，本发明的传感器通过电信号检测葡萄糖，所 述电信号来自在功能化的SWNT(连接至检测电路）上进行的葡萄糖氧化酶反应。其不需要 任何额外的化学反应（例如，过氧化物酶反应）或光学检测手段来检测反应产物。
[0044] 图1显示了所述传感器的一个实施方式。信号调节器和微控制器可以替换为任何 现有的电化学分析装置，并且可以配置为用于固定使用（stationary use)(也即，作为全包 含的或独立的单元）、或者用于远距离使用（也即，含有用于与分离的数据分析系统无线通 讯的发射器）、以及用于使用微流控系统进行持续监测。该系统的核心是含有已经用葡萄糖 氧化酶功能化的SWNT的传感器。
[0045] 所述传感器通常含有三个电极：工作电极、反电极、和参比电极。葡萄糖氧化酶附 着至所述工作电极的组件。将含葡萄糖的溶液滴至传感器，其在此接触所有的三个电极。通 过电流分析的方法来测量存在的葡萄糖的量。优选对电极的形状和它们之间的面积比例进 行了优化，以产生对测试中使用的唾液体积而言最佳的结果。图2显示了实例。唾液体积 的范围可以是几纳升至几毫升或更多。
[0046] 为了将纳米传感器功能化以用于检测唾液中的葡萄糖，所述工作电极可涂覆有含 有葡萄糖氧化酶的多层结构（GOx)。将GOx涂覆至所述工作电极上的过程包括逐层组装以 形成多层薄膜。在一个实施方式中，每一层含有壳聚糖、金纳米颗粒、和葡萄糖氧化酶亚层。 此类涂覆材料提供了就准确性、可重复性、和持续性而言最佳的结果。可在用SWNT涂覆之 前，使用聚烯丙基胺（PAA)或者另外的阳离子聚合物来修饰电极表面。PAA提供了氨基基 团，其高度带正电并且可被吸附至工作电极的表面，如Pt电极。可以通过加入SWNT水悬液 并使所述SWNT附着至表面来将SWNT沉积在基材表面、或者更优选地沉积于PAA层表面。功 能化的SWNT和逐层涂覆方法的组合大大地提高了检测的准确性和灵敏性，使得能够以低 至10-20秒或更少的应答时间在临床相关范围内检测唾液中低水平的葡萄糖。可以对传感 器形状和层的数目进行优化，以改善准确性和灵敏性。无论传感器形状以及所用的涂覆层 的数目如何，传感原理都是相同的。
[0047] 图3A和3B显示了逐层组装以制备多层薄膜来涂覆所述工作电极的过程的实例。 在此实例中，所述多层薄膜的每一层由壳聚糖、金纳米颗粒、和葡萄糖氧化酶亚层组成。所 述SWNT的-COOH末端之一与电极表面上的PAA反应，形成了 CO-NH键，而所述SWNT另一 末端的-COOH提供了带负电的基团通过静电吸引作用与壳聚糖（CS)反应。金纳米颗粒 (GNp)可以通过范德华力与CS和葡萄糖氧化酶关联。此类自组装的组合在其它系统中已有 研究（42-43)。CS-GNp-GOx单元层可以重复多次以形成多层涂层。层的数目可以进行调节 以实现最佳的传感性能。例如，CS-GNp-GOx单元层可以重复以形成2-10层，或者形成2-5 层，或形成3-5层，或形成3-6层，或形成4-6层，或形成4-7层，或形成5-8层。也可以使 用单一层的CS-GNp-GOx。
[0048] 也可以使用其它材料来形成多层薄膜以及来涂覆电极表面。例如，PAA可以替换 为一或多种其它聚阳离子聚合物，如聚（L-赖氨酸）（PLL)、聚乙烯亚胺（PEI)和聚酰胺-胺 树状聚合物。SWNT可以替换为石墨或碳纳米纤维和/或纳米线。本发明任何地方使用的 GNp均可更换为Pt、Ru、Sn、Fe3O4的纳米颗粒或者其它金属或半导体纳米颗粒。壳聚糖也 可替换为例如牛血清白蛋白（BSA)或普鲁士蓝。逐层组装顺序也可以重新安排或者变为使 用类似的材料以不同的安排或次序进行，只要满足上文所述的键的类型或范德华力相互作 用。在用葡萄糖氧化酶功能化所述电极之后，可以加入半透膜（如Nafion或脂质双层膜） 来作为过滤层以过滤液体样品并作为葡萄糖氧化酶的保护层从而减少其降解。初步结果表 明此类添加的层没有减缓传感器应答或降低唾液中低水平葡萄糖检测灵敏性的不良影响。 适当功能化的SWNT与逐层涂覆方法的组合大大提高了以低至10-20秒或更少的应答时间 在临床相关范围内检测唾液中葡萄糖量的检测准确性。对此类低浓度葡萄糖及其与血液葡 萄糖关联的测量使得传感器能够不仅检测高血糖也能检测低血糖，这在糖尿病的监测和监 控中是非常重要的。
[0049] 图3C和3D显示了制备多层薄膜来涂覆所述工作电极的组装方法的另外的实例。 在此方法中，将SWNT直接沉积至所述工作电极的金属表面并通过非共价相互作用附着至 电极表面。此实施方式的电极表面未涂覆PAA。在此方法的一个变化中，所述电极表面直接 涂覆有壳聚糖，且在沉积壳聚糖之前并未涂覆SWNT。在此过程中（不管是否包括SWNT)，多 层薄膜的每一层依然是由壳聚糖、金纳米颗粒、和葡萄糖氧化酶亚层组成。金纳米颗粒通过 非共价力（例如范德华力）与壳聚糖和葡萄糖氧化酶（GOx)关联。CS-GNp-GOx单元层可以 重复一或多次以形成多层涂层。为了高灵敏性，重复CS-GNp-GOx单元层以形成若干层。
[0050] 组装方法的另一实施方式包括在基材上使用丝网印刷（screen printing)。图3E 和3F显示了 一个这种方法。此方法可任选省略所述SWNT层