纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种传感器的制备技术，尤其涉及一种利用纳米孔阵列构建人气味结 合蛋白传感器的方法，以及利用纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器检测与疾病相关的脂 肪酸（二十二碳六烯酸）分子和醛类分子（苯甲醛）的方法。
【背景技术】
[0002] 人气味结合蛋白属于脂质运载蛋白中的一种，是一种低分子量、可溶性蛋白，主要 存在于人嗅觉神经细胞外侧的淋巴液中。其作用是与目标脂溶性分子可逆地结合，并运输 此类疏水性小分子至嗅觉细胞上的嗅觉受体，进而促使产生嗅觉。人类能够检测并区分上 亿种不同的气味刺激，其中人气味结合蛋白发挥了非常重要的作用。现阶段，基于气味结合 蛋白的传感器已经受到了很多人的重视，而石英晶体微天平，表面等离子体共振，电化学阻 抗等传感器的研究也已经开展，但是检测下限，灵敏度等仍不能满足要求。除此之外，研究 所用气味结合蛋白主要来自于昆虫和其他哺乳动物，将人气味结合蛋白作为敏感元件构建 传感器的很少。因此，利用纳米孔和人气味结合蛋白结合的纳米级别的优势，发展一种基于 电化学阻抗分析的纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器，以期实现高灵敏的检测特异性配 体分子，可以用于化学分子、疾病标志物检测及人气味结合蛋白特性研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于对现有技术的不足，提供一种基于纳米孔阵列的人气味结合蛋 白传感器的制备及应用。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于纳米孔阵列的人气味结合 蛋白传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0005] (1)加工纳米孔阵列材料：采用标准的两步阳极氧化法制备。将纯度为99. 99%以 上的铝箱裁剪成长X宽为20mmX 20mm的基片，进行机械抛光后依次在超纯水、丙酮溶液中 用超声脱脂清洗l〇min，取出后用超纯水淋洗，用氮气吹干后以基片作为阳极，铜片作为阴 极在0. 25M的草酸中进行一次氧化3h，然后用超纯水淋洗后把基片放入质量百分比为4% 的铬酸和质量百分比为8%的磷酸混合液中进行5min刻蚀，除去一次阳极氧化多孔氧化铝 层，然后用超纯水淋洗后进行15min的二次氧化，条件与第一次氧化条件完全相同，第二次 刻蚀溶液为质量百分比为8%的磷酸和0.1 M的氯化铜混合溶液，时间为5min，取出基片，用 超纯水淋洗后即得到纳米孔阵列材料；
[0006] (2)纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器的构建，该步骤通过以下子步骤来实 现：
[0007] (2. 1)首先，将纳米孔阵列材料裁剪成的纳米孔阵列，面积大于反应皿中 间通道，然后将其固定于反应皿的中间，再向反应皿的两侧中加入超纯水，浸泡24h后，依 次用无水乙醇和超纯水清洗上述的反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干；
[0008] (2. 2)配制5mM的2-羧乙基磷酸溶液，溶剂为超纯水；将2-羧乙基磷酸溶液加入 反应皿的两侧，2-羧乙基磷酸溶液体积为使得纳米孔阵列恰好完全浸泡在2-羧乙基磷酸 溶液中。在室温下，避光静置72h，2-羧乙基磷酸中的磷酸根吸附于纳米孔阵列的表面，进 而将2-羧乙基磷酸固定于纳米孔阵列上。之后再吸出反应皿中残留的2-羧乙基磷酸溶液， 然后用超纯水清洗反应皿及纳米孔阵列，最后用氮气吹干；
[0009] (2. 3)在反应皿的两侧分别加入8mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐）溶液和12mg/ml的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的 体积均为2-羧乙基磷酸溶液体积的二分之一，EDC溶液的溶剂为0.1 M MES缓冲液，NHS溶 液的溶剂为〇. IM PBS缓冲液，室温下静置15min后，再加入饱和NaHCO3溶液调节反应皿中 溶液 pH 至 7. 2-7. 4 ;
[0010] (2. 4)在反应皿的两侧分别加入与EDC溶液等体积的20 μ g/ml人气味结合蛋白 溶液，人气味结合蛋白溶液的溶质为人气味结合蛋白，溶剂为〇. IM PBS缓冲液，内含质量百 分比为5%的海藻糖和质量百分比为5%的甘露醇。将反应皿置于4°C条件下静置2h，使得 人气味结合蛋白与2-羧乙基磷酸溶液中的2-羧乙基磷酸的羧基发生脱水缩合作用而形成 稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出反应皿中残留的液体，再向反应皿两侧加满 0.1 M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，即可获得基于纳米孔阵列的人气味结合蛋 白传感器，置于4°C条件下备用。
[0011] 应用上述基于纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器检测脂肪酸和醛类物质的方 法，包括以下步骤：
[0012] (1)配制苯甲醛和二十二碳六烯酸的标准样品溶液：采用分析纯为99%的苯甲醛 和分析纯为99%的二十二碳六烯酸标准贮备溶液分别稀释配制5种不同浓度梯度的标准 样品溶液，稀释液是分析纯为99%的甲醇溶液；
[0013] (2)纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器构建的表征：首先是三电极检测系统的 连接，先将三电极中金工作电极的一端连接电化学工作站的工作输入端，金工作电极的另 一端插入反应皿中；银/氯化银参比电极的一端连接电化学工作站的参比输入端，铂丝对 电极的一端连接电化学工作站的对电极输入端。银/氯化银参比电极和铂丝对电极的另外 一端同时插入反应皿的另外一侧（与金工作电极分别位于反应皿的两侧）。当反应皿中间 没有纳米孔阵列时，向反应皿的两侧中分别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积氧化还原对 溶液，氧化还原对溶液中含有IOmM铁氰化钾、IOmM亚铁氰化钾和〇. IM的KCl，溶剂为超纯 水，再向反应皿的两侧中分别加入与氧化还原对溶液等体积的甲醇溶液，直接进行电化学 阻抗图谱扫描，具体测试参数为初始电压为0. 2V，交流电压幅度为5mV，扫频范围为IHz~ 1MHz，最后得到无纳米孔阵列的电化学阻抗图谱。之后利用相同的测量方法，测量纳米孔阵 列固定于反应皿中的电化学阻抗图谱，以及纳米孔阵列上固定人气味结合蛋白之后的电化 学阻抗图谱，利用检测到的三条电化学阻抗图谱表征纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器 的构建。
[0014] (3)检测苯甲醛标准样品溶液：三电极检测系统的连接及具体测试参数同步骤2， 测试传感器是纳米孔阵列的人气味结合蛋白传感器，首先进行空白对照溶液电化学阻抗图 谱的测量，向反应皿的两侧中分别加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积的氧化还原对溶液，氧 化还原对溶液中含有IOmM铁氰化钾、IOmM亚铁氰化钾和0.1 M的KC1，溶剂为超纯水，再向 反应皿的两侧中分别加入与氧化还原对溶液等体积的甲醇溶液，通过电化学工作站对纳米 孔阵列的人气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描，得到电化学阻抗图谱。测量结 束后吸出反应皿两侧中残留的溶液，然后向反应皿的两侧均加满PBS缓冲液，静置5min后 缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗纳米孔阵列，消除上次测量残留的铁氰化钾/亚铁氰化钾及 PBS缓冲液的混合溶液影响。之后再进行苯甲醛标准样品溶液的检测，向反应皿的两侧分别 加入与2-羧乙基磷酸溶液等体积的氧化还原对溶液和已知物质的量浓度的苯甲醛标准样 品溶液，进行电化学阻抗图谱的测量，得到该物质的量浓度下的苯甲醛标准样品溶液对应 的电化学阻抗图谱。测量结束后吸出反应皿两侧中残留的溶液，然后向反应皿的两侧均加 满PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗纳米孔阵列。
[0015] (4)重复步骤3中苯甲醛标准样品溶液的电化学阻抗图谱的测量过程，直至完成5 种不同浓度梯度的苯甲醛标准样品溶液