一种端粒长度测量方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料制备及生物分子检测技术，尤其涉及一种单细胞内高灵敏度的端粒长度测量方法，借助表面增强拉曼散射(SERS)的高灵敏度以及光谱信息丰富的特点，通过原位杂交技术实现单细胞内的端粒长度测量，该方法也可称为原位杂交表面增强拉曼散射法。
【背景技术】
[0002]端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，其作用是保护染色体DNA的末端，避免染色体DNA的降解、末端融合以及非正常重组等。在哺乳动物细胞中，端粒DNA由TTAGGG序列重复串联组成。由于DNA的末端复制问题，细胞的每次分裂都伴随着端粒DNA —小段序列的丢失。细胞的每次分裂都会伴随着染色体末端端粒的缩短，细胞也因此逐渐老化、直至丧失增殖能力而死亡。端粒长度的变化与多种疾病密切相关，如癌症、早衰综合征等。因此测量端粒长度能提供与疾病相关的重要信息。
[0003]目前已有的端粒长度测量方法包括=Southern印迹法、杂交保护法(HPA)、实时荧光定量PCR法(qPCR)和荧光原位杂交(FISH)法。用Southern印迹法分析的DNA是没有被打碎和纯度较高的，但该方法得到的数据还包括了部分亚端粒区长度，因此Southern印迹法不能提供端粒的实际长度。HPA法中，直接将基因组DNA与端粒特异性的吖啶酯探针杂交，通过化学发光法测定端粒长度。该方法中不需要用到放射性同位素，大大降低了对实验操作人员的伤害，同时对基因组完整性和纯度没有苛刻要求。但HPA法没有给出详细的细胞或染色体水平的端粒信息，也不能直接测定端粒长度。PCR法使用PCR扩增的方式，有效降低了细胞基因组DNA的用量。FISH法利用端粒特异性肽核酸荧光探针，结合荧光显微镜技术，能实现单细胞水平的端粒长度分析。尽管这些方法在端粒研究中做出了重要的贡献，但它们或多或少具有一些不足，比如灵敏度低、程序复杂、成本高等，因此，目前仍需设计出灵敏度高、准确性好、适用性广泛、可操作性强的端粒长度测量技术。
[0004]在生物研究中，除传统生物学检测方法外，光学检测技术以其简单、可靠的特点获得了较为广泛的应用。现有的光学测试方法以荧光技术为主流获得了较为广泛的应用。作为另一种光谱技术，拉曼光谱携带有被测分子的结构“指纹”信息，因而具有更重要的生物学应用价值。但由于其光谱信号强度太弱，限制了它的应用。表面增强拉曼散射(SERS)现象的发现彻底解决了这个问题，从而使得它成为一种强有力的技术分析手段。SERS —方面继承了拉曼光谱的诸多优点，如对生物组织损伤小、光谱信息丰富等；另一方面，它弥补了传统拉曼散射信号强度弱、不利于检测的缺点。其巨大的增强作用使得基于SERS的光谱检测具有超高的灵敏度，甚至可实现单分子水平的分析研究。SERS光谱的“指纹”特性使人们能在复杂的生物环境中跟踪、检测目标分子。SERS效应产生在纳米尺度粗糙的金属表面，纳米技术的飞速发展为构筑多功能化的SERS纳米探针/基底提供了丰富的技术途径。这些基于SERS光谱技术的纳米探针/基底在生物成像、核酸或蛋白检测、肿瘤识别、药物输运等诸多生物医学领域展现出了优异的应用前景。
【发明内容】
[0005]发明目的:为解决目前端粒长度测量方法灵敏度不高、操作复杂、成本高的问题，，本发明提供一种用于细胞端粒长度测量的原位杂交SERS法，借助SERS的高灵敏度以及光谱信息丰富的特点，通过原位杂交技术实现单细胞内的端粒长度测量。
[0006]技术方案:为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]一种端粒长度测量方法，使用端粒SERS探针粒子与着丝粒SERS探针粒子分别标记待测细胞的端粒与着丝粒，并使用端粒SERS探针粒子与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/e表征待测细胞的端粒长度，即使用长度保持不变的端粒序列作为内部参照，消除SERS探针、染色体或细胞的浓度的影响；该方法具体为:将端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子加入到用固定剂固定好的待测细胞上，使端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上，利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/C表征待测细胞的端粒长度，RtA；越小表示待测细胞的端粒长度越短；所述端粒SERS探针粒子是一种能与细胞的端粒序列杂交的SERS探针粒子，所述着丝粒SERS探针粒子是一种能与细胞的着丝粒序列杂交的SERS探针粒子。
[0008]上述方法具体包括如下步骤:
[0009]步骤一:制备球形金纳米粒子A ;
[0010]步骤二:在粒子A表面修饰与细胞的端粒互补的DNA序列5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’，得到能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子B1;在粒子A表面修饰与细胞的着丝粒互补的DNA序列5’ -SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’，得到能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子B2;
[0011]步骤三:在粒子B1表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子C1;在粒子B 2表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子C2;要求在粒子B:和粒子B 2表面修饰的拉曼报告分子不同，使得粒子C1和粒子C2产生的SERS信号不同；
[0012]步骤四:在粒子C1表面包覆一层银壳形成端粒SERS探针粒子D1，银壳将粒子D1上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列(即SH(CH2) 6TTTTTTTTTTT)包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列(即CCCTAACCCTAACCCTAA)仍旧暴露在银壳外；在粒子C2表面包覆一层银壳形成着丝粒SERS探针粒子D2,银壳将粒子队上的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列(即SH(CH2)6ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ)包埋在内，而用于杂交的一段DNA序列(即AGCTTCTGTCTAGTTT)仍旧暴露在银壳外；银壳的厚度为2?3nm(厚度不可超过3.4nm)，通过银壳进一步增强SERS信号，但同时又不影响DNA序列的杂交功能；
[0013]步骤五:用固定剂固定好待测的细胞；
[0014]步骤六:将粒子D1和粒子D 2同时加入到用固定剂固定好的待测细胞中，使粒子D I和粒子D2分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上；
[0015]步骤七:洗去待测细胞上多余的粒子D1和粒子D 2；
[0016]步骤八:利用共焦拉曼显微镜分析待测细胞上的SERS光谱信号，进行SERS光谱和图像的采集；
[0017]步骤九:利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/e表征待测细胞的端粒长度，R τ/ε越小表示待测细胞的端粒长度越短。
[0018]所述步骤二中，DNA 序列 5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’ 和 DNA 序列 5’ -SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’ 的 5’ 端均修饰了巯基，以使得两种 DNA序列能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面。
[0019]所述步骤三中，两种拉曼报告分子均含巯基，以使得拉曼报告分子能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面；要求使用的两种拉曼报告分子的拉曼散射截面较大，便于产生强SERS信号。
[0020]有益效果:本发明提供的端粒长度测量方法，相对于现有技术，具有如下优势:1、本发明中的探针粒子能提供SERS信号，具有超高的灵敏度，可用于单细胞水平的分析研究；2、本发明中采用长度不变的着丝粒作为内部参考，能有效避免探针、细胞、染色体浓度等因素的影响，提高端粒长度测量的准确性；3、本发明采用SERS探针原位杂交实现端粒长度测量，具有实验成本低、周期短、特异性好、定位准确的优点。
【附图说明】
[0021]图1为本发明提出的原位杂交SERS法测量端粒长度的示意图；
[0022]图2为本发明中使用的SERS探针的结构示意图；
[0023]图3为实施例1中端粒SERS探针的SERS光谱；
[0024]图4为实施例1中着丝粒SERS探针的SERS光谱。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0026]如图1所示为一种端粒长度测量方法，将端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子加入到用固定剂固定好的待测细胞上，使端粒SERS探针粒子和着丝粒SERS探针粒子分别通过它们表面修饰的DNA序列杂交到待测细胞的端粒和着丝粒上，利用端粒SERS探针粒子的SERS信号强度与着丝粒SERS探针粒子的SERS信号强度之比RT/e表征待测细胞的端粒长度，RT/e越小表示待测细胞的端粒长度越短；如图2所示，所述端粒SERS探针粒子是一种能与细胞的端粒序列杂交的SERS探针粒子，所述着丝粒SERS探针粒子是一种能与细胞的着丝粒序列杂交的SERS探针粒子。该方法包括如下步骤:
[0027]步骤一:制备球形金纳米粒子A ;
[0028]步骤二:在粒子A表面修饰与细胞的端粒互补的DNA序列5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’，得到能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子B1;在粒子A表面修饰与细胞的着丝粒互补的DNA序列5’ -SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’，得到能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子B2;两种DNA序列的5’端均修饰了巯基，以使得两种DNA序列能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面；
[0029]步骤三:在粒子B1表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的端粒序列杂交的金纳米粒子C1;在粒子B 2表面的空位上修饰拉曼报告分子，得到能产生SERS信号且能与细胞的着丝粒序列杂交的金纳米粒子C2;要求在粒子B:和粒子B 2表面修饰的拉曼报告分子不同，使得粒子C1和粒子C2产生的SERS信号不同；两种拉曼报告分子均含巯基，以使得拉曼报告分子能够通过金硫键牢固地、共价地连接到粒子A的表面。
[0030]步骤四:在粒子C1表面包覆一层银壳形成端粒SERS探针粒子D:，银壳将粒子D1I的拉曼报告分子和富T碱基的一段DNA序列包埋在内，而用于