人类非小细胞肺癌相关的血浆代谢小分子标志物及其应用
【专利说明】人类非小细胞肺癌相关的血浆代谢小分子标志物及其应用 发明领域
[0001] 本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及人类非小细胞肺癌相关的血浆代谢小 分子标志物及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全世界男性和女性癌症相关死亡最常见的原因。据估计，2012年全球肺癌 新发病例1800万，占全部肿瘤新发病例的12. 9%，死亡病例1600万，占全部肿瘤相关死亡 的19. 4%。肺癌按照细胞类型分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌（15% )，非小细胞肺癌有两 个主要的亚型为腺癌（40% )、鳞状细胞癌（30% )，依据类型不同其治疗和预后也不同。
[0003] 目前临床用于诊断肺癌的影像学检查方法有：胸部X射线、CT (computed tomography，电子计算机 X 射线断层扫描）、PET_CT(Positron Emission Tomography/ Computer Tomography,正电子发射计算机断层扫描），这些检查存在一些缺陷，福射对身体 的影响以及较高的经济负担。临床上常用的侵入性检查方法有：支气管镜下肺活检及CT引 导下经皮肺穿刺活检，这些检查往往是需要消耗一定的时间，同时给患者带来一定的创伤 风险。除了以上这些检查，外周血中肺癌相关的肿瘤标志物检测也较常使用，但是这些标志 物的敏感性及特异性均较低。因此迫切需要寻求一个非辐射、微创、不昂贵同时高度敏感及 特异的诊断方法。
[0004] 代谢组学（Metabolomics/Metabonomics)是继基因组学、转录组学、蛋白质组学 之后迅速崛起的一门新兴学科，已成为系统生物学的重要组成部分。它是研究生物体系受 外部刺激或扰动后所产生的内源性代谢物整体机器变化规律的科学，是探明生物体系代谢 途径的研究方法。代谢组学的研究对象是相对分子质量l〇〇〇Da以下的小分子物质，包括： 糖类、氨基酸、脂类、有机酸、肉碱等。
[0005] 正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于 一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代 谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。在肿瘤的发生及发展过程中，肿瘤细胞受到外界 环境的刺激，其内环境发生的微小变化多会引起代谢物的"延增效应"，使代谢物发生异乎 寻常的变化。通过代谢组学分析了解代谢小分子在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找 有关的生物标志物（biomarker)可以辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本 身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。代谢组学自出现 以来，引起了各国科学家极大的兴趣，短短十余年来获得了迅速发展。代谢组学在病理阐 述、药物设计开发、疾病诊断、分型以及疾病预后等领域表现出巨大潜力。
[0006] 自从Warburg假设由于线粒体缺陷改变的代谢对癌症细胞的特异性，代谢生物标 志物已受到研究者的关注，是一种对早期癌症诊断和预后有效的生物标志物。从那时起，许 多努力致力于肿瘤学中代谢生物标志物的鉴定。直至现在只有两个代谢生物标志物已进入 临床实践，分别是甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素，作为预测嗜铬细胞瘤疾病状态 的标志物。代谢组学研究的关键在于对大量小分子代谢产物进行快速、准确的分析鉴定，这 在很大程度上依赖于相关技术的进步。核磁共振、质谱、色谱等技术的发展和联用，使得代 谢组学的广泛应用成为可能。
[0007] 目前，代谢物整体水平的检测分析技术包括液相色谱-质谱联用（LC-MS)、气象色 谱-质谱联用（GC-MS)及核磁共振技术（NMR)。NMR特点是对待测组分无破坏，样本前处理 简单，但灵敏度较低、检测动态范围窄；GC-MS具有较好的灵敏度和重现性，但一般要采用 衍生化方法对样本进行前处理，使得实验步骤变得复杂。相比GC-MS而言，LC-MS能分析高 极性和分子量相对更高的化合物，更适合于代谢组学生物样本中复杂代谢产物的检测和潜 在标志物的鉴定。此外，更具有样本处理简单，灵敏度高，临床实用性强的特点，故而采用 LC-MS进行代谢小分子的代谢组学分析，若能发现稳定的与非小细胞肺癌发病相关的特异 血衆代谢小分子作为生物标志物，并研发相应疾病的代谢小分子标志的LC-MS检测方法， 不仅在该领域处于国际领先地位，可创造令人瞩目的经济效益，对我国非小细胞肺癌的早 期发现、早期诊断也将是一次强有力的推动。
[0008] Maeda等通过研究非小细胞肺癌与健康者的血浆氨基酸轮廓，探讨了氨基酸轮 廓作为非小细胞筛选指标的可能性，并发现6个敏感性和特异性均较高的诊断标志物。 Duarte等对尚未经过放疗和化疗的初期肺癌患者和健康志愿者的血浆样品进行了系统分 析，认为内源性代谢物的改变出现在疾病的初期阶段，且可能与癌症生化过程相关，如增强 性的糖酵解和糖异生以及受到抑制的三羧酸循环和脂代谢。Carrola等对肺癌患者与健 康者的尿液进行了代谢组学研究，结果发现肺癌尿液中马尿酸盐和萌芦巴碱含量降低，而 羟基异戊酸、羟基异丁酸、N-乙酰谷氨酰胺和肌酐相对对照组升高。Fan T等利用 13C稳定同位素示踪代谢组学分析法"SIRM"，对非小细胞肺癌患者癌组织与癌旁非癌组织 进行了研究。既往研究均提示了肿瘤的代谢异常，并在不同程度发现了差异性的代谢物，可 作为预测肿瘤发展的标志物。但是，代谢组学研究在临床应用上存在几个关键的问题，除了 技术本身对研究的影响外，不同生理状态，比如性别、年龄、饮食、昼夜变化、文化对代谢组 的影响也越来越受到重视。因此在疾病或治疗标志物的筛选中需要特别注意这些影响因 素，此外还需结合数学的方法以排除这些影响因素，以更好地应用于临床。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种非小细胞肺癌相关的血浆代谢小分子标志物。
[0010] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
[0011] 非小细胞肺癌相关的血浆代谢小分子标志物，该标志物为皮质醇、皮质酮和4-甲 氧基苯乙酸中的一种或多种。
[0012] 所述的血浆代谢小分子标志物，该标志物由皮质醇、皮质酮和4-甲氧基苯乙酸构 成。
[0013] 上述三种标志物含量范围（95 %置信区间）分别为，皮质醇（0.00018~ 0? 00067)、皮质酮（0? 000029 ~0? 00010)，4-甲氧基苯乙酸（0? 000015 ~0? 000022)，代 谢物在上述范围内可以提示肿瘤的发生。正常组相应的水平范围为皮质醇（0.0030~ 0? 0037)、皮质酮（0? 00044 ~0? 00056)，4-甲氧基苯乙酸（7. 39E-07 ~2. 09E-06)。
[0014] 本发明详细描述如下：
[0015] 本发明人以标准操作程序（S0P)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群 基础信息和临床资料，并采用了基于UPLC/MS的代谢组学方法进行分析。
[0016] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
[0017] -、研究对象选择和分组依据
[0018] A组：健康对照组（n = 112, 56人筛选，56人独立人群验证）：
[0019] 1.年龄在42岁至80岁间；
[0020] 2.经体检未诊断为肿瘤，既往无肿瘤病史；
[0021] 3?无其他全身性重大疾病；
[0022] 4?无长期用药的慢性病史。
[0023] B组：非小细胞肺癌组（n = 99, 53人筛选，46人独立人群验证）：
[0024] 1.年龄在42岁至83岁间；
[0025] 2.经手术或穿刺病理初诊为非小细胞肺癌；
[0026] 3?无其他全身性重大疾病；
[0027] 4?无长期用药的慢性病史。
[0028] 二、UPLC-MS代谢组学分析和非小细胞肺癌诊断用代谢小分子筛选和验证
[0029] 1?样本前处理
[0030] 1. 1新鲜血液于离心机3000rpm离心5min，取上清100 y 1分装至洁净1. 5ml EP 管中。
[0031] 1. 2 100 y 1血浆用300 y 1甲醇沉淀蛋白。
[0032] 1.3吸取上清，平均分成2份，用氮气吹干再用真空干燥。
[0033] 1. 4用50 y L水（含0? 1 %的甲酸）溶解一份干燥物（酸性提取物），另一份干燥 物用50 y L含6. 5mM的重碳酸铵pH = 8的水溶解（碱性提取物）。
[0034] 2?仪器检测
[0035] 2. 1 分析仪器：米用 Waters Acquity 公司的 UPLC 串联 ThermoFisher LTQ-FT 线 性离子阱回旋共振质谱仪。
[0036] 2. 2液相条件：
[0037] 2.2. 1液相色谱柱为Waters BEH C18 1.7 ym 100mm色谱柱，柱温为40度。
[0038] 2. 2. 2酸性提取物：采用的流动相为㈧含0. 1 %甲酸的水和⑶含0. 1 %甲酸的 甲醇，流速为 350 yL/min。1.2 仪器梯度为：0-4min 0%B 到 70%B，4-4. 5min70%-9