一种牛体外受精囊胚双重染色的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于牛体外受精生物技术领域，涉及牛体外受精囊胚的质量评价方法，更 具体的说是一种简便、快速的牛囊胚双重染色方法。
【背景技术】
[0002] 自从牛IVP体系的成功建立开始，人们试图从不同的角度对这一体系进行改进， 例如改变培养系统、添加脂质代谢调节因子（lipid metabolic regulators).、添加 cAMP调节因子（Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) modulators)等，但和体内胚胎 相比牛体外胚胎的质量仍然较差，不仅囊胚细胞数较少而且移植妊娠率也不高。这使得人 们认识到提高牛胚胎质量的必要性，为此胚胎质量的检验逐渐成为评估体外培养体系好坏 的重要指标之一。与传统单一染色方法相比，双重染色方法能清晰的将囊胚内细胞团（ICM) 和滋养层细胞（TE)区分开来，在评估上具有更高的准确性。目前的囊胚双重染色方法是 在Thous等利用TritonX-100对囊胚双重染色的基础上建立起来的，但是存在的最大问 题是程序繁琐，每步染色花费时间多，整个染色程序下来最少在47min以上，因此染色时间 长(李瑞岐，桑润滋.以囊胚双重染色方法检验果糖对牛胚胎早期发育效果的影响[J]. 中国畜牧杂志，2010 (9): 23-25;李荣，刘颖，赵兴波，等.无血清培养基IVDlOl和 G1/G2在牛体细胞核移植中的应用研究[J].畜牧兽医学报，2008, 39(11) :1487-1492; Thouas G A, Korfiatis N A，French A J， et al. Simplified technique for differential staining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovine blastocysts[J]. Reproductive biomedicine online, 2001，3(1): 25-29. )〇
[0003] 通常在评价囊胚质量时，因胚胎日龄、发育阶段不同，需要对胚胎进行分类，多批 次染色，因此染色花费时间长，效率低，并可能影响染色的效果。
[0004] 为了降低囊胚双重染色所需时间，提高效率，我们经过试验摸索，对牛体外受精囊 胚的双重染色步骤进行了优化，3min即可完成染色，而以前的报道中最少需要47min。因此 大大降低了囊胚双重染色所需时间，提高了效率。
【发明内容】
[0005] 为实现上述目的，本发明公开了一种牛体外受精囊胚双重染色的方法，包括（1)卵 母细胞的采集；（2)体外成熟培养；（3)体外受精；（4)胚胎的体外培养；（5)囊胚双重染 色五个步骤，其特征在于步骤（5)囊胚双重染色：它是将培养至7-9d的牛囊胚用0. 5%(w/ w) Pronase (链霉蛋白酶）处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲液）中洗2-3遍，在IOOPg/ ml PI (碘化丙啶）（l%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS)中染色20s，于PBS中 洗2-3遍后移入45Pg/ml Hoechst33342 (双苯酰亚胺）中染色50s，用PBS洗2-3遍后进行 压片，压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团（ICM)细胞核呈蓝色， 滋养层（TE)细胞细胞核呈红色。
[0006] 本发明更加详细的描述如下： 1. 卵母细胞的采集 牛卵巢取自屠宰场，卵巢置于37°C加有青霉素、链霉素的生理盐水中，2~3h运回实验 室，除尽周围脂肪组织，然后用加有青霉素、链霉素的生理盐水冲洗5~6次，用采卵液抽吸 法吸取直径2~8mm的卵泡，根据实验不同的需求挑选裸卵、半裸卵及具有三层及其以上卵 丘的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs)用于试验； 采卵液：TCM-199(组织培养基）+5% FBS(胎牛血清）+3〇μ8/πι1 !feparin(肝素 钠）+4.766g/l Hepes (4-轻乙基哌嗪乙磺酸） 2. 体外成熟培养 将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40-60个移入平衡至少2h的Iml成熟液中 (四孔板)，于5%C02、95%空气、38. 5°C、饱和湿度的CO2培养箱中培养23~24h ;若卵丘细胞共 培养则用微滴法（ιοομL)，以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志； 成熟液：TCM-199+10% FBS+l(^g/ml FSH(促卵泡激素）+2〇μ8/πι1 LH(促黄体素）+?μ8/ ml E2 (雌二醇）； 3. 体外受精 受精液为 IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan，用直接离心法对精子进行洗涤，即用6ml受精液稀释解冻的精液并于2000r/min下 离心7分钟，弃去上清液，重复一次后用受精液稀释精子，密度为I X 106~6 X IO6个/ml，然 后放入0)2培养箱中备用，IVF-100受精时间为6h ; 4. 胚胎的体外培养 将经体外受精的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍，并用Iml移液管部分或全部去除 周围的卵丘细胞，以10枚假定受精卵/ιοομL微滴将假定受精卵随机平等的移入平衡至少 2h的微滴中进行体外培养，从体外受精开始算起，第48h对各组卵裂率进行观察与记录，第 7-9d对各组囊胚率进行观察与记录，中途不进行换液，胚胎培养液为CRlaa。
[0007] ?囊胚双重染色 我们对传统的囊胚双重染色方法进行了改进，最重要的改进就是在保证染色效果的前 提下，缩短相应步骤的操作时间，具体方法如下：将培养至7~9d的牛囊胚用0. 5% Pronase (链霉蛋白酶）处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲液）中洗2~3遍，在lOOPg/ml PI (碘 化丙啶）（l%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS)中染色20s，于PBS中洗2~3遍后 移入45Pg/ml Hoechst33342(双苯酰亚胺)中染色50s，用PBS洗2~3遍后进行压片，压片后 置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团（ICM)细胞核呈蓝色，滋养层（TE) 细胞细胞核呈红色。
[0008] 本发明重点解决了传统的囊胚双重染色法，相应步骤染色处理时间多，造成整个 染色程序时间长，效率低的问题。本发明的简便、快速的牛囊胚双重染色法就是优化每一 步染色步骤，在保证染色效果的前提下，尽量缩短染色时间，从而整体减少囊胚双重染色时 间，这一结果为简便、快速评价囊胚质量奠定了基础。
[0009] 本发明公开的简便、快速的牛囊胚双重染色法与现有的技术相比所具有的优点在 于： 通过优化牛体外受精囊胚的双重染色的每一步骤，在保证染色效果的前提下，尽量缩 短染色时间，3min即可完成染色，而以前的报道中最少需要47min。因此大大降低了囊胚双 重染色所需时间，提高了效率，从而可快速对牛囊胚质量做出评价。
[0010]
【附图说明】： 图1为改进的囊胚双重染色效果图。
[0011]
【具体实施方式】： 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，使本领域专业技术人员更好的理解本发 明。实施例仅为解释性的，绝不意味着它以任何方式限制本发明的范围。特别加以说明的 是： TCM199 (组织培养基)、FCS (胎牛血清)、PBS (磷酸缓冲液）购自Gibco公司；FSH (促 卵泡激素 ）、LH (促黄体素）购自宁波激素制品厂；17β-Ε2 (雌二醇)、H〇CheSt33342 (双苯 酰亚胺）、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、PI (碘化丙啶)、Ifepes (4-羟乙基哌嗪 乙磺酸）、Heparin(肝素钠 )、Pronase (链霉蛋白酶）购自Sigma公司；IVF-100受精液 贝勾自 Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan。
[0012] 实施例1: I.材料与方法 I. I卵母细胞的采集 牛卵巢取自屠宰场，卵巢置于37°C加有青霉素、链霉素的生理盐水中，2~3h运回实验 室，除尽周围脂肪组织，然后用加有青霉素、链霉素的生理盐水冲洗5~6次，用采卵液抽吸 法吸取直径2~8mm的卵泡，根据实验不同的需求挑选裸卵、半裸卵及具有三层及其以上卵 丘的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs)用于试验； 采卵液：TCM-199(组织培养基）+5% FBS(胎牛血清）+3〇μ8/πι1 !feparin(肝素 钠）+4.766g/l Hepes (4-轻乙基哌嗪乙磺酸） 1. 2体外成熟培养 将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40-60个移入平衡至少2h的Iml成熟液中 (四孔板)，于5%C02、95%空气、38. 5°C、饱和湿度的CO2培养箱中培养23~24h ;若卵丘细胞共 培养则用微滴法（ιοομL)，以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志； 成熟液：TCM-199+10% FBS+l(^g/ml FSH(促卵泡激素）+2〇μ8/πι1 LH(促黄体素）+?μ8/ ml E2 (雌二醇）； 1. 3体外受精 受精液为 IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan，用直接离心法对精子进行洗涤，即用6ml受精液稀释解冻的精液并于2000r/min下 离心7分钟，弃去上清液，重复一次后用受精液稀释精子，密度为I X 106~6 X IO6个/ml，然 后放入0)2培养箱中备用，IVF-100受精时间为6h ; 1. 4胚胎的体外培养 将经体外受精的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍，并用Iml移液管部分或全部去除 周围的卵丘细胞，以10枚假定受精卵/ιοομL微滴将假定受精卵随机平等的移入平衡至少 2h的微滴中进行体外培养，从体外受精开始算起，第48h对各组卵裂率进行观察与记录，第 7-9d对各组囊胚率进行观察与记录，中途不进行换液，胚胎培养液为CRlaa。
[0013] 改进的囊胚双重染色 我们对传统的囊胚双重染色方法进行了改进，最重要的改进就是在保证染色效果的前 提下，缩短相应步骤的操作时间，具体方法如下：将培养至7~9d的牛囊胚用0. 5% Pronase (链霉蛋白酶）处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲