一种金不换药材中多种生物碱含量测定方法
【技术领域】
[0001] 中药质量分析技术领域，涉及一种金不换药材多成分含量检测方法。
【背景技术】
[0002] 广西特色药材金不换是千金藤属防己科植物金不换块根，又名地不容、山乌龟，主 要分布于广西、云南、四川等地，生长于海拔480米的地区，见于石灰岩地区的石山上，是广 西壮族等少数民族民间常用草药]。《广西中药材标准》第二册收载的金不换有三个品种， 分别为广西地不容 H.S.Lo、小花地不容 H.S.LoetM.Yang、桂南地不容 Arawgsieftsi··?H.S.LoetM.Yang。金不换块根 入药，味苦而辛，性凉，有小毒，其功能为清热解毒、散瘀消肿、健胃止痛，用于胃、十二指肠 溃疡疼痛、上呼吸道感染、急性胃肠炎、菌痢、牙痛、神经痛、痈疮肿毒、跌打肿痛等病症。块 根富含多种具有生物活性的生物碱，例如：延胡索乙素、千金藤碱、克班宁、青藤碱、青风藤 碱、巴马汀、千金藤宁碱、罗默碱、去氢罗默碱等。
[0003] 近年金不换市场需求量持续增加，野生资源逐年减少，人工栽培发展缓慢，使得 金不换资源蕴藏量和产量都在大幅下降，导致市场上出现了很多伪劣品，给金不换质量和 用药安全性及有效性带来了很大的冲击，已成为制约金不换药材系列开发的瓶颈。
[0004] 目前针对该药材的传统的形态特征和理化特性的鉴别方法具有一定的局限性， 不足以从整体上控制金不换质量，金不换作为一味临床常用中药，，有必要建立一种科学 的其多成分含量检测方法对金不换质量进行评价。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种利用高效液相色谱法测定广西特色药材金不换的多种 生物物碱含量的方法。本发明所要解决的技术问题在于金不换成分复杂，富含多种有生物 活性的生物碱成分，现有技术或方法无法满足对金不换进行多成分质量检测的问题，进而 提供一种准确度高、简便、快速的检测金不换质量的方法。为全面和综合评价该药材提供重 要的判断依据，保证质量稳定和临床疗效安全可靠。
[0006] 本发明的技术方案： 一种金不换药材中多种生物碱含量测定方法，其特征在于对延胡索乙素、巴马汀和青 藤碱同时进行测定。
[0007] 具体包括如下步骤： a) 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-〇. 5%磷酸水溶液为流动相， 梯度洗脱：流动相梯度程序见表1，流速：1.OmL/min，柱温：室温，检测波长：282nm，理 论塔板数按延胡索乙素计不低于4000 ; b) 对照品混合溶液制备 精密称取延胡索乙素、巴马汀和青藤碱等适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制 成延胡索乙素浓度为lmg/mL和巴马汀浓度为lmg/mL和青藤碱浓度为0.lmg/mL的溶液； c) 供试品溶液制备 取金不换药材粉末(过60目筛）精密称定2g，置于100ml锥形瓶中，精密加入50-60% 乙醇溶液100mL，称定重量，超声15min，回流提取60min，放冷，用50-60%乙醇补足减失的 重量，用0. 45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得； d) 测定 分别精密吸取对照品混合溶液和供试品溶液各10-20μL，注入液相色谱仪，测定，即 得。
[0008] 本发明的优点或积极效果： 本发明可用于金不换药材的多种生物碱有效成分含量检测和控制，为全面和综合评价 该药材提供重要的判断依据。本发明解决了金不换成分复杂而传统法局限性以及其质量难 以把控的技术问题，提供了一种准确度高，操作简便快速，成本低廉的多成分检测方法， 具有良好的应用前景和经济效益。
【附图说明】： 图1金不换药材高效液相色谱图（Α.对照品混合溶液色谱图Β.供试品溶液色谱图）
【具体实施方式】
[0009] 下面结合最佳实施举例对本发明进一步说明，但本发明保护范围并不仅限于以下实 施举例。
[0010] 实施举例1 : 1.材料 1. 1主要仪器 高效液相色谱仪：岛津LC-20A，配置紫外检测器，色谱工作站，日本岛津公司；超纯 水制造系统：成都越纯科技有限公司；数控超声波清洗器：KQ-500DB型，昆山市超声仪器 有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：101-1-S，上海跃进医疗器械厂；低温冷却液循环栗： DLSB-5/20,郑州长城科工贸有限公司；循环水式真空栗：SHZ-D(III)，巩义市英峪予华仪 器厂；电热恒温水浴锅：GSY-n不锈钢，北京市医疗设备厂；真空干燥箱：D2F-250,郑州长 城科工贸有限公司；电子分析天平：ME215S，北京赛多丽斯仪器系统有限公司；多功能粉 碎机：ST-02A100g，永康市帅通工具有限公司。
[0011] 1.2试剂与药品 金不换：购于广西境内及周边多个药材市场，为广西医科大学附属肿瘤医院刘宗河教 授所鉴定为防己科千金藤属植物广西地不容StephaniakwangsiensisH.S.Lo、小花地不 容StephaniamicranthaΗ·S.LoetM.Yang、桂南地不容StephaniakwangsiensisH.S.Lo etM.Yang的干燥块根，10份金不换药材来源情况见表1。
[0012] 对照品：延胡索乙素，批号110726-201414,含测用，中国食品药品检定研究院； 巴马汀，批号13022707,含测用，成都贝斯特试剂有限公司；青藤碱，批号110774-200507， 含测用，中国食品药品检定研究院；千金藤碱，批号2111647-200301，含测用，中国食品药 品检定研究院；异紫堇定碱，批号Y-195-140211，含测用，成都瑞芬思生物科技有限公司。
[0013] 磷酸、乙醇：分析纯；甲醇、乙腈：色谱纯；等。
[0014] 2 方法 2. 1色谱条件和系统适用性试验 采用Hypersil0DS2 5μηι(4. 6mmX250mm)色谱柱，以乙腈-〇. 5%磷酸水溶液为流动 相，梯度洗脱：流动相梯度程序见表1，流速：1.OmL/min，柱温：室温，检测波长：282nm， 进样量：10μL，所有色谱峰达到基线分离，供试品溶液中延胡索乙素峰保留时间与相应对 照品峰保留时间一致，且在60分钟内完成。理论塔板数按延胡索乙素计不低于4000,均与 相邻杂峰分离度>1.5。色谱图参见图1。
[0015] 2.2对照品溶液制备 精密称取延胡索乙素对照品250mg，巴马汀对照品250mg，青藤碱对照品25mg，置于 5〇mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得备液。精密量取备液2mL，置于10mL容量 瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液，其中延胡索乙素浓度为lmg/mL 和盐酸巴马汀浓度为lmg/mL和青藤碱浓度为0.lmg/mL。
[0016] 2. 3供试品溶液制备 取金不换药材粉末(过60目筛)精密称定2g，置于100ml锥形瓶中，精密加入50%乙醇 溶液100mL，称定重量，超声15min后，回流提取60min，放冷，用50%乙醇补足减失的重量， 用0. 45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
[0017] 2.4线性和范围考察 分别精密吸取对照品混合溶液备液0. 5mL、lmL、2mL、3mL、4mL、5mL置于10mL容量瓶，加 甲醇稀释定容至刻度，摇匀即得标准系列混合溶液①~⑥，进样量：20yL，注入色谱仪， 按上述色谱条件测定相应峰面积，以浓度为横坐标（X)、峰面积为纵坐标（Y)，分别绘制三 种成分的标准曲线。 设线性方程为Y=bX+a，将上述各组实验数据代入该方程中计算，进行线性回归，得到三 种成分回归方程分别为： Y 延胡索乙素=1.80X105X- 1.70X105，r= 0.9999 Y 巴马汀=1· 30Χ105Χ- 3· 90X104，r= 0. 9998 Y 青藤碱=1· 90X105X+ 1· 96X104，r= 0. 9999 结果表明：延胡索乙素在浓度〇· 25mg/mL~2. 5mg/mL范围内，巴马汀在浓度0· 25mg/mL~2. 5mg/mL范围内，青藤碱在浓度0. 025mg/mL~0. 25mg/mL范围内，与峰面积呈较好的 线性关系。
[0018] 2.5精密度试验 同一浓度对照品混合溶液，按上述色谱条件，进样20μL，1d内连续进样6次，测定 峰面积，计算，延胡索乙素、巴马汀和青藤碱峰面积日内精密度RSD分别为0. 14%、0. 18%、 0.16%;同一浓度对照品混合溶液，按上述色谱条件，进样20yL，连续3d每天进样2 次，测定峰面积，计算，延胡索乙素、巴马汀和青藤碱峰面积日间精密度RSD分别为0. 49%、 0. 35%、0. 68%，表明精密度良好。
[0019] 2.6稳定性试验 同一供试品溶液，间隔不同时间测定，在〇h、2h、4h、8h、10h、12h、24h各进样20yL，按 上述色谱条件测定峰面积，计算RSD。结果：延胡索乙素、巴马汀和青藤碱峰面积RSD分别 为0. 53%、0. 71%、0. 68%，表明供试品溶液在24h内稳定。
[0020] 2. 7重复性试验 取同一批样品6份，制备供试品溶液，进样量20μL，按上述色谱条件测定峰面积，计算 含量和RSD，结果：延胡索乙素、巴马汀和青藤碱含量RSD分别为0. 82%、0. 59%、0. 62%，表明 方法重复性较好。
[0021] 2.8加样回收试验 精密称取同批金不换（已知其中延胡索乙素、巴马汀和青藤碱的百分含量）lg，置具 塞锥形瓶中，精密添加适量对照品混合溶液备液（延胡索乙素、巴马汀和青藤碱浓度分别 为5mg/mL、5mg/mL、0. 5mg/mL)，平行试验6份，进样量20μL，按样品含量测定项测定峰面 积，计算含量和回收率。结果：延胡索乙素平均回收率为97. 97%，RSD为0. 98%，巴马汀平均 回收率98. 53%，RSD为1. 07%,青藤碱平均回收率96. 75%，RSD为1. 13%。
[0022] 2.9样品测定 利用上述色谱条件测定金不换药材中延胡索乙素、巴马汀和青藤碱含量，参见图1和 表1。图1中，Α为对照品混合溶液色谱图，Β为供试品溶液色谱图；其中，峰1、2、3分别为 延胡索乙素、巴马汀和青藤碱。
[0023] 由表1中数据，进行比较，可看出品种来源、产地、采收加工等因素对金不换药材 质量影响较大。
[0024] 以上试验显示，该测定方法稳定可靠。通过对基地实施GAP管理，严控化肥、农药、 采收加工等环节，使金不换药材质量可靠。
【主权项】
1. 一种金不换药材中多种生物碱含量测定方法，其特征在于对延胡索乙素、巴马汀和 青藤碱同时进行测定，具体方法如下： a) 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-〇. 5%磷酸水溶液为流动相， 梯度洗脱：流动相梯度程序见表1，流速：1.0mL/min，柱温：室温，检测波长：282nm，理 论塔板数按延胡索乙素计不低于4000 ; b) 对照品混合溶液制备 精密称取延胡索乙素、巴马汀和青藤碱等适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制 成延胡索乙素浓度为lmg/mL和巴马汀浓度为lmg/mL和青藤碱浓度为0.lmg/mL的溶液； c) 供试品溶液制备 取过60目筛的金不换药材粉末，精密称定2g，置于100ml锥形瓶中，精密加入50-60% 乙醇溶液100mL，称定重量，超声15min，回流提取60min，放冷，用50-60%乙醇补足减失的 重量，用0. 45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得； d) 测定 分别精密吸取对照品混合溶液和供试品溶液各10-20μL，注入液相色谱仪，测定，即 得。
【专利摘要】本发明公开了一种金不换药材中多种生物碱含量测定方法，包括对延胡索乙素、巴马汀和青藤碱同时进行测定，该方法准确度高、简便、快速，可为全面综合评价药材提供重要的判断依据。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105372342
【申请号】CN201510568928
【发明人】王捷, 蒋伟哲, 叶勇, 苏志恒, 蒋敏捷, 巫玲玲
【申请人】广西医科大学制药厂
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年9月9日